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血紅蛋白的制備方法

2021/11/5 11:00:05

背景及概述[1]

血紅蛋白是血紅細(xì)胞中的最主要蛋白成分,同時(shí)也是血液的主要蛋白成分,在紅細(xì)胞中還含有微量的超氧化物歧化酶(S0D)、碳酸酐酶、糖酵解酶系等,在血漿部分則含有200多種功能不同的蛋白組分,有的屬多酶系統(tǒng)如補(bǔ)體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)和激肽原系統(tǒng)等,有的屬免疫球蛋白類、蛋白酶抑制物、轉(zhuǎn)輸?shù)鞍最?、類脂蛋白類等?/p>

制備[1-3]

報(bào)道一、

S1、血液的選?。菏紫葟尼t(yī)院或醫(yī)療機(jī)構(gòu)收取過(guò)期人血,然后通過(guò)稱量設(shè)備量取所需體積的過(guò)期人血,備用;

S2、血漿的去除:將步驟S1量取的過(guò)期人血倒入離心設(shè)備中,然后以轉(zhuǎn)速為450r/min,溫度為28℃的條件下旋轉(zhuǎn)離心15min,之后沉淀35min,即可完成將過(guò)期人血中的紅細(xì)胞分離出來(lái),然后采用緩沖液系統(tǒng)將分離出來(lái)的紅細(xì)胞洗滌2次,洗滌液常用等紅細(xì)胞體積的等滲溶液如生理鹽水,該洗滌過(guò)程也同時(shí)除去來(lái)白細(xì)胞和血小板,能夠去除血漿蛋白和部分膜磷脂,緩沖液系統(tǒng)為125mM的NaCl、13mM的葡萄糖、2.5mM的MgCl2、54mM的KH2PO4和19mM的K2HPO4組成的緩沖溶液,使用該緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行洗滌,能夠防止紅細(xì)胞的破裂和維持穩(wěn)定的胞內(nèi)環(huán)境;

S3、血紅蛋白的釋放:經(jīng)過(guò)步驟S2得到堆積的血紅細(xì)胞后,先把紅細(xì)胞置于腎透析儀中,再倒入低滲溶液中透析1.5h,使紅細(xì)胞逐斷膨脹以至膜破裂,然后再將透析后的混合溶液轉(zhuǎn)移至0,lμm的超濾制備中,從而過(guò)濾出血紅蛋白溶液,其中基本上不含有任何脂類,通過(guò)低滲溶液來(lái)溶脹紅細(xì)胞,使部分膜孔打開(kāi)以釋放血紅蛋白,限度地釋放血紅蛋白而又較完整地保存了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),低滲溶液為2.5mM的MgCh、6mM的K2HPO4和2.4mM的KH2PO4組成的混合溶液,腎透析儀選自型號(hào)為BC2600的全自動(dòng)血細(xì)胞透析儀;

S4、基質(zhì)的除去:將步驟S3得到的血紅蛋白溶液轉(zhuǎn)移至離心設(shè)備內(nèi),在25000g的離心力下,離心時(shí)間為80min,除去紅細(xì)胞膜及膜碎片基質(zhì),然后分類上清液,將所得的上清液依次過(guò)0.45和0.2pm濾膜以進(jìn)一步除去更小的基質(zhì)和病菌,之后使用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH和鹽離子濃度,所得的上清液是含有微量雜蛋白和脂類的血紅蛋白溶液,pH調(diào)節(jié)劑為1mol/L的碳酸鈉溶液;

S5、血紅蛋白的純化:用100kd的濾膜或病毒濾器過(guò)濾,以起到脫磷脂或病毒的作用,再通過(guò)凝膠排阻層析柱對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行分離,即可得到血紅蛋白純品,血紅蛋白的純化可除去99.7%以上的磷脂和99,9%以上的血型抗原,凝膠排阻層析柱為WatersQMA-Acell柱,該層析柱一次能夠得到21g血紅蛋白,且需時(shí)僅為1h。

報(bào)道二、

取新鮮抗凝牛血,用0.9%NaCl洗滌血液三次,用冷水溶解紅細(xì)胞。在4℃條件下,離心30分鐘,去除細(xì)胞碎片和未溶解的細(xì)胞,上清液即為待純化的血紅蛋白溶液;向待純化的血紅蛋白溶液中加入填充劑Na2SO4,按100ml待純血紅蛋白溶液加入2.85g填充劑Na2SO4,得到待純化血紅蛋白樣品;上樣前,用平衡液0.2M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡親和層析色譜的介質(zhì),親和層析所用介質(zhì)為CM Sephadex-Sulfanilamide,然后將制備好的待純化血紅蛋白樣品上樣,直至與介質(zhì)層面齊平,得到流穿液,即為純化的血紅蛋白。

報(bào)道三、

整個(gè)過(guò)程在2~6℃條件下進(jìn)行:

1、將加入了抗凝劑如肝素的豬動(dòng)脈血離心去除血漿、白細(xì)胞、血小板,用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2~4次,低速離心后得到壓積紅細(xì)胞;

2、用2~8倍壓積紅細(xì)胞體積的低滲溶液如0.01M NaCl或低滲PBS溶解壓積紅細(xì)胞,通入氮?dú)饣驓鍤獾榷栊詺怏w,在溶血液中加入pH值為7.0~7.4的維生素C至溶液pH值達(dá)到7.0~7.4,再加入保護(hù)劑如葡萄糖至終濃度為1~5%,加入青霉素和鏈霉素等常規(guī)抑菌藥物,充分?jǐn)嚢?~4小時(shí),高速離心10~30分鐘后得到粗制血紅蛋白溶液;

3、往粗制血紅蛋白溶液中加入體積是粗制血紅蛋白溶液1/10~1/4的甲苯,震蕩搖勻后低溫條件下萃取2~6小時(shí),取下層血紅蛋白溶液進(jìn)行透析;

4、將血紅蛋白溶液裝入透析袋中,在加有抗氧化保護(hù)和抑菌藥物的透析液中透析36~72小時(shí),中間更換1~3次透析液,去除殘留甲苯和小分子物質(zhì);

5、將透析后的血紅蛋白溶液加入適量保護(hù)劑冷凍真空干燥成干粉后,溶解成高濃度、小體積的液體,上樣于葡聚糖凝膠層析柱純化,收取分子量均一的高純度血紅蛋白;

6、經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌去熱原,然后冷凍干燥成高純度無(wú)基質(zhì)無(wú)熱源的血紅蛋白干粉保存于2~8℃。

應(yīng)用[4]

高密度發(fā)酵技術(shù)一直是工業(yè)生產(chǎn)中要求的高效技術(shù)。對(duì)于很多需氧微生物,在發(fā)酵過(guò)程中限制細(xì)胞密度的最為重要的因素是氧氣的利用。因此需要開(kāi)發(fā)出了多種針對(duì)提高需氧微生物氧氣利用率的技術(shù)。

CN201510845454.3提供了一種利用血紅蛋白提高發(fā)酵細(xì)胞密度的方法。本發(fā)明提供了一種提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度的方法,通過(guò)在細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)血紅蛋白和/或細(xì)胞表面展示(surfacedisplay)血紅蛋白,和/或重塑細(xì)胞外膜的方法,促進(jìn)血紅蛋白與氧氣的接觸,從而提高氧氣的利用效率,實(shí)現(xiàn)提高微生物發(fā)酵密度。實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明構(gòu)建的工程菌可以提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度以及胞內(nèi)積累產(chǎn)物PHB的含量。

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