概述

1970年人們首次發(fā)現(xiàn)外源性耐熱性腸毒素(heat-stableenterotoxin，STa)能夠激活小腸上皮細(xì)胞的某種受體進(jìn)而引起分泌性腹瀉。1990年確定該受體為GC-C，而后進(jìn)一步明確了體內(nèi)天然的GC-C激動劑有鳥苷蛋白(Guanylin)和尿鳥苷素(Uroguanylin)。2005年首個人工合成的GC-C激動劑利那洛肽在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中證明了其可提升糞便硬度和質(zhì)量，于2012年被美國FDA和歐洲EMA批準(zhǔn)用于治療成人IBS-C，2019年在中國上市。

制備[3]

醋酸利那洛肽制備如下：

步驟1：Fmoc-Tyr(tBu)-2-ClTrt-樹脂的合成

取500g取代值為0.6mmol/g的2-ClTrt-Cl樹脂，加入DMF溶脹樹脂。取0.6molFmoc-Tyr(tBu)-OH，用適量DMF溶解，加入到上述樹脂中，攪拌均勻后再加入1.2molDIPEA，攪拌反應(yīng)3小時，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2-ClTrt-樹脂，取代值為0.45mmol/g。

步驟2：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂的合成

取500g取代值為0.5mmol/g的Wang樹脂，加入DMF溶脹樹脂。取0.5molFmoc-Tyr(tBu)-OH，用適量DMF溶解，加入到上述樹脂中，攪拌均勻后再加入1.0molDIC、0.4molHOBt、0.04mol4-N，N-二甲基吡啶，攪拌反應(yīng)6小時，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，取代值為0.39mmol/g。

步驟3：利那洛肽肽樹脂的制備

取0.1mol步驟2的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang-樹脂(取代值0.39mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保護(hù)25分鐘，洗滌過濾，得到去Fmoc的H-Tyr(tBu)-Wang-樹脂。取0.3molFmoc-Cys(Trt)-OH和0.3molHOBt，用適量DMF溶解，另取0.28molHBTU，攪拌下慢慢加入，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，再加入0.56molDIEA，混勻后加入到上述H-Tyr(tBu)-Wang-樹脂中，偶聯(lián)反應(yīng)120～180分鐘，反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，洗滌過濾，再用20％PIP/DMF溶液去保護(hù)25分鐘，洗滌過濾，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang-樹脂。同上法依次接入表3剩余保護(hù)氨基酸，得到利那洛肽肽樹脂：

H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Wang-樹脂

步驟4：利那洛肽線性肽粗品的制備

取利那洛肽樹脂，加入體積比為TFA︰水︰EDT＝90︰5︰5的混合酸解液(用量10mL/克利那洛肽樹脂)，攪拌均勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時，反應(yīng)混合物使用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液后減壓濃縮，加入無水乙醚沉淀，再用無水乙醚洗沉淀3次，抽干得類白色粉末，真空減壓干燥至恒重，得利那洛肽線性肽粗品，純度為84.7％。

步驟5：利那洛肽粗品純化

取利那洛肽粗品用0.45μm微孔濾膜過濾，純化備用。采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，純化用色譜填料為10μm的反相C18，流動相系統(tǒng)為0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度系統(tǒng)洗脫，循環(huán)進(jìn)樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，收集主峰蒸去乙腈后，得利那洛肽純化中間體濃縮液；取利那洛肽純化中間體濃縮液，用0.45μm濾膜濾過備用；采用高效液相色譜法進(jìn)行換鹽，流動相系統(tǒng)為1％醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜填料為10μm的反相C18，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度洗脫，循環(huán)上樣方法，上樣于色譜柱中，啟動流動相洗脫，采集圖譜，觀測吸收度的變化，收集換鹽主峰并用分析液相檢測純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到醋酸利那洛肽，冷凍干燥，得利那洛肽純品66.4g，總收率為43.5％，分子量：1527.8(100％M+H)，純度：99.3％，單一雜質(zhì)為0.09％。

主要參考資料

[1] CN201710672918.4一種利那洛肽的純化方法

[3] CN201510314459.3一種合成利那洛肽的方法