背景^[1-3]

豬腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素?？贵w與結(jié)合在包被抗體上的抗原結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，抗原濃度與OD450值之間呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中指標(biāo)的濃度。

豬腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒

豬腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持

2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

豬腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品

孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸

及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。

4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。

5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

8.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

9.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

應(yīng)用^[4][5]

豬腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒可以用于血清腸三葉因子（TFF3）在非小細(xì)胞肺癌的診斷及化療療效評(píng)估中的意義

探討腸三葉因子(Trefoil Factor 3,TFF3)在非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)患者的診斷及化療療效評(píng)估中的作用,為診斷和治療非小細(xì)胞肺癌提供新的腫瘤標(biāo)志物。

方法:選取2020年06月20日至2021年06月06日于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科初次確診的84例非小細(xì)胞肺癌患者[肺鱗癌(LUSC)38例,肺腺癌(LUAD)46例]作為非小細(xì)胞肺癌組,同一時(shí)期在本醫(yī)院進(jìn)行體檢的21例健康者為對(duì)照組,跟蹤僅接受培美曲塞(LUAD)或紫杉醇(LUSC)+鉑類方案連續(xù)化療2個(gè)周期的非小細(xì)胞肺癌患者作為化療組。使用豬腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者初次確診時(shí)、連續(xù)化療2個(gè)周期后、健康對(duì)照組體檢第一天血清TFF3水平。采集非小細(xì)胞肺癌患者初次確診時(shí)外周靜脈血實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù))、神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段21-1(CYFRA21-1)。下載腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的肺鱗癌、肺腺癌數(shù)據(jù),分析TFF3表達(dá)水平與化療療效的關(guān)系。

豬腸三葉因子(ITF)ELISA試劑盒結(jié)果:1.在非小細(xì)胞肺癌組中,肺腺癌和肺鱗癌患者化療前血清TFF3的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.在血小板計(jì)數(shù)≥中位數(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者血清中,TFF3的水平高于血小板計(jì)數(shù)<中位數(shù)組的非小細(xì)胞肺癌患者(P<0.05)。3.血清TFF3水平診斷非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.73[95%CI(0.62,0.83)],0.69[95%CI(0.56,0.82)],0.77[95%CI(0.66,0.89)],約登指數(shù)分別為0.45,0.37和0.55,截?cái)嘀捣謩e為1109.37pg/ml,1109.37pg/ml和1110.61pg/ml。4.在接受化療的非小細(xì)胞肺癌患者中,化療后血清TFF3水平顯著低于化療前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。亞組分析顯示:肺腺癌患者化療后血清TFF3水平顯著低于化療前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而肺鱗癌患者化療前后血清TFF3水平無(wú)明顯變化。5.通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中非小細(xì)胞肺癌患者組織中TFF3水平與化療效果之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)對(duì)化療效果敏感的肺腺癌患者具有更高的TFF3表達(dá)水平(P<0.05),而肺鱗癌患者化療效果與TFF3的表達(dá)水平之間未發(fā)現(xiàn)明顯關(guān)系(P>0.05)。

參考文獻(xiàn)

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