背景^[1-3]

TRPV5抗體是一種IgG2aκ小鼠單克隆TRPV5抗體（也稱為TRPV5抗體），它通過WB、IP、IF和ELISA檢測(cè)小鼠、大鼠和人類來源的TRPV5蛋白。TRPV5抗體（B-8）既以非偶聯(lián)抗TRPV5抗體形式提供，也以多種偶聯(lián)形式的抗TRPV5抗體提供，包括瓊脂糖、HRP、PE、FITC和多種Alexa Fluor?偶聯(lián)物。瞬時(shí)受體電位（TRP）蛋白是陽離子敏感通道，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括溫度感覺和血管調(diào)節(jié)。從VR-1旁基因轉(zhuǎn)錄而來的熱敏感、辣椒素不敏感的TRPV3在溫暖溫度下表達(dá)；其表達(dá)量會(huì)隨著有害溫度的增加而增加。人類TRPV3在皮膚、舌頭、背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、脊髓和大腦中表達(dá)。此外，TRPV3與VR-1在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中共表達(dá)。TRPV3與VR-1相關(guān)聯(lián)，并可能調(diào)節(jié)VR-1的活性。由729個(gè)氨基酸組成的TRPV5（ECAC1）蛋白包含六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、多個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)、一個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)和三個(gè)錨蛋白重復(fù)區(qū)域。它在腎臟、空腸和胰腺中大量表達(dá)，在睪丸、前列腺、胎盤、大腦、結(jié)腸和直腸中的表達(dá)水平較低。TRPV5控制腎臟和腸道中維生素D3調(diào)節(jié)的Ca2+重吸收的限速步驟；TRPV5的5′-側(cè)翼區(qū)域包含四個(gè)推定的維生素D3反應(yīng)元件。

TRPV5抗體

TRPV5抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（TRPV5抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(TRPV5抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

TRPV5抗體可以用于TRPV5在頭孢曲松結(jié)石大鼠模型腎臟中的表達(dá)及意義

通過構(gòu)建頭孢曲松鈉結(jié)石大鼠模型,探討鈣離子通道蛋白TRPV5在頭孢曲松鈉結(jié)石模型組大鼠和正常對(duì)照組大鼠的表達(dá)差異,其表達(dá)的量與頭孢曲松鈉干預(yù)時(shí)間的相關(guān)性,為研究頭孢曲松鈉相關(guān)腎結(jié)石的發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

方法:將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組,編為A、B、C三組,其中A組給予120mg/kg/d蒸餾水灌胃4周,B組、C組給予頭孢曲松鈉溶液120mg/kg/d分別灌胃2周和4周;試劑盒檢測(cè)各組血、尿生化指標(biāo);相差顯微鏡下觀察A、B、C三組腎臟組織病理切片中結(jié)晶形成情況;采用TRPV5抗體免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠腎組織TRPV5的定性表達(dá);采用TRPV5抗體雙抗體夾心法定量各組大鼠腎組織中TRPV5表達(dá)水平。

TRPV5抗體結(jié)果:三組血鈣濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),C組與A組比較血肌酐明顯升高[(96.29±21.81)umol/L vs(34.72±10.49)umol/L,P<0.05],C組與B組比較血肌酐升高[(96.29±21.81)umol/L vs(59.98±20.45)umol/L,P<0.05];C組尿鈣濃度相比較A組明顯升高[(0.72±0.25)mmol/L vs(0.46±0.23)mmol/L,P<0.01],C組與A組比較尿肌酐降低[(2488.28±435.75)umol/L vs(3463.57±221.76)umol/L,P<0.01]。C組中TRPV5蛋白在腎臟中表達(dá)明顯低于A組、B組[(217.79±48.31)ng/L vs(395.66±74.69)ng/L、(343.08±74.08)ng/L,P<0.01],TRPV5在三組血清中的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。

參考文獻(xiàn)

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[5]孫允冀.TRPV5在頭孢曲松結(jié)石大鼠模型腎臟中的表達(dá)及意義[D].蘭州大學(xué),2016.