介紹
考馬斯亮藍(lán)快速染色液(Coomassie Blue Fast Staining Solution)是以考馬斯亮藍(lán)G250為染料,可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白凝膠的無污染、快速、高靈敏染色,或Western轉(zhuǎn)膜后PAGE膠上殘余蛋白的檢測。18分鐘即可檢測到100ng條帶,約40分鐘可檢測到10ng條帶,約50分鐘即可獲得背景非常低的凝膠染色,約150分鐘即可獲得幾乎完美的無背景染色的蛋白條帶。
操作步驟
1 電泳結(jié)束后,切取少量含有MARK蛋白以及少許樣品的小部分凝 膠進(jìn)行染色,其余部分用保鮮膜包好,放在4℃冰箱保存。 取凝膠放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液中,確保染色液可以充分覆蓋凝膠。置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動,室溫染色1小時(shí)或更長時(shí) 間。 注:具體的染色時(shí)間取決于凝膠的厚度和染色時(shí)的溫度。凝膠較厚, 溫度較低,則染色時(shí)間宜適當(dāng)延長。凝膠較薄,溫度較高,則染色時(shí) 間可以適當(dāng)縮短。通常染色至凝膠的顏色和染色液的顏色非常接近, 在染色液中幾乎看不清凝膠時(shí),可以認(rèn)為已染色充分。染色2-4 個(gè)小 時(shí)或更長時(shí)間不會對最終的染色效果產(chǎn)生負(fù)面影響。
2 倒出染色液。染色液可以回收重復(fù)使用至少2-3 次。
3 加入適量考馬斯亮藍(lán)染色脫色液,確保脫色液可以充分覆蓋凝膠。 置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動,室溫脫色 4-24 小時(shí)。期間更換脫色液2-4 次,直至藍(lán)色背景基本上全部被脫去,并且蛋白條帶染 色效果達(dá)到預(yù)期。通常蛋白條帶在脫色1-2 小時(shí)后即可出現(xiàn)。 注:脫色期間可以在脫色液中加入一片吸水紙,可以使部分染料吸附 在吸水紙上,加快脫色。脫色時(shí)間過長也會導(dǎo)致蛋白條帶的顏色變淺。
4 完成脫色后,用ddH2O浸泡,至于未染色凝膠長度相等時(shí),參照 MARK 蛋白,與未染色凝膠對比,切下所需蛋白成分的凝膠,收集起來。然后把所要提純的蛋白從凝膠中分離出來。
常見問題
1、無染色條帶:可能上樣量太少,建議電泳時(shí)加適當(dāng)量的BSA等作為陽性對照。
2、背景太高:可能雜質(zhì)沒有除盡,建議延長最初的蒸餾水洗滌時(shí)間或增加洗滌次數(shù)。也可以在完成染色后,把凝膠放置在蒸餾水中在室溫或4℃進(jìn)行洗滌。在4℃蒸餾水中浸泡一段時(shí)間,通??梢匀〉幂^好的脫色效果。
3、染色條帶的靈敏度不夠理想:可以使用考馬斯亮藍(lán)快速染色液進(jìn)行重復(fù)染色,重復(fù)染色可以改善染色效果。在加熱情況下染色可以顯著提高檢測靈敏度,另外染色后在室溫或4℃用蒸餾水進(jìn)行脫色也可以顯著改善染色的靈敏度。
4. 考馬斯亮藍(lán)沾到皮膚:考馬斯亮藍(lán)和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合,反應(yīng)快速,并且穩(wěn)定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無礙。