概述
固紫B是一種棕黃色偶氮染料，可溶于極性及非極性溶劑，當(dāng)前其主要用于偶氮偶聯(lián)法中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色，也可作為呈色劑用于電泳法中血清AST同工酶檢測。偶氮染料等紡織染料用于生物細(xì)胞化學(xué)染色由來已久，最初由Enrlish首創(chuàng)，并將其應(yīng)用于血液及骨髓細(xì)胞染色，Kass等不斷深入研究并取得滿意效果，國內(nèi)李順義等發(fā)現(xiàn)耐曬黑G、堿性品藍(lán)可分別對粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞特異性著色[1-2]。上述研究均是關(guān)于造血細(xì)胞的染色，而有關(guān)BMsC細(xì)胞化學(xué)染色研究鮮見報道。基于此本研究建立了將偶氮染料固紫B鹽應(yīng)用于BMSC的特異性細(xì)胞化學(xué)染色方法。
具體應(yīng)用
建立骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMsc)固紫B鹽細(xì)胞化學(xué)染色法，并評估其臨床應(yīng)用價值。方法將傳代培養(yǎng)的BMSC、骨髓、胸腔積液及腹腔積液標(biāo)本制成涂片，行固紫B鹽染色，觀察細(xì)胞的著色情況及陽性BMsc形態(tài)特征，計數(shù)和比較再生障礙性貧血組(從)、增生性貧血組與健康對照組骨髓標(biāo)本的BMsc數(shù)；并以健康對照組BMsc數(shù)的下限值作為從的診斷界點，隨機(jī)雙盲法評估該方法的診斷價值，計算敏感度、特異度、陽性似然比及陰性似然比。結(jié)果BMSC胞質(zhì)染成紫紅色，胞核不著色，其他細(xì)胞(粒、紅、巨三系，單核、巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，漿細(xì)胞，問皮細(xì)胞等)均不染色；從組BMsc計數(shù)為(1.07±0.29)個，增生性貧血組為(2.26±0．37)個，健康對照組為(1.58±0.33)個，從組BMsc計數(shù)明顯低于增生性貧血組和健康對照組(g值分別為24.29、8.83，P均<0.01)，健康對照組低于增生性貧血組(g=16.41，P<0.01)；本法診斷從的敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比分別為90％、93％、12.86、0.11。結(jié)論固紫B鹽染色方法操作簡便，特異性強，對骨髓的增生程度評價及貧血的鑒別診斷具有較高的診斷價值。
應(yīng)用過程
（1）標(biāo)本采集：吸取患者骨髓、胸腔積液或腹腔積液50山制成涂片。健康對照者骨髓液2 ml，采用Percoll密度梯度分離法分離并培養(yǎng)BMSC，細(xì)胞按1：3比例傳代，傳代培養(yǎng)4代后用胰酶消化，洗滌，得單個核細(xì)胞懸液，約3×106／ml，室溫下560×g離心5 min。棄上清液，細(xì)胞沉淀混勻，推片。
（2）固紫B鹽染色：上述新鮮干燥標(biāo)本于固定液固定30 s，小水流沖洗后晾干，置入l g／L固紫B鹽PBS溶液(pH 7．2—7．6)，37℃水浴箱內(nèi)置30 IIlin，流水沖洗1 min，晾干后蘇木精復(fù)染2 min，流水沖洗，待干。鏡下觀察細(xì)胞的著色情況及陽性BMSC形態(tài)特征，并計數(shù)貧血組、健康對照組和隨機(jī)雙盲法選取的150份骨髓標(biāo)本全片的BMSc陽性數(shù)。
傳代BMSC固紫B鹽染色后，低倍鏡下可見彌漫陽性的BMSC；油鏡下觀察BMSC胞核不著色，胞質(zhì)呈紫紅色，并見陽性顆粒(圖1)。而以固紅RC、固紅GG鹽、固紅VR鹽、固紅ITR鹽、固藍(lán)B鹽、固藍(lán)RR鹽、固藍(lán)BB鹽、固紫醬GBC鹽染色作對比觀察，均未見陽性細(xì)胞。
（3）診斷效能評估：以健康對照組骨髓標(biāo)本BMSC數(shù)的下限值作為診斷AA的參考上限，并以臨床診斷AA的標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，評估該方法診斷AA的敏感度、特異度、陽性似然比及陰性似然比。
（4）統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。首先對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，若實驗數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，則用中位數(shù)及百分位數(shù)表示：肘(P25，P75)；經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，若呈正態(tài)分布，均數(shù)比較采用方差分析及q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
研究意義
通過對常用偶氮染料的廣泛篩選，發(fā)現(xiàn)固紫B鹽可使BMsc著色，經(jīng)過系列實驗，如改變固定液種類、固定時間、pH值、染色時間及緩沖液等，建立并優(yōu)化了固紫B鹽對BMSc特異染色的各項參數(shù)(如pH 7．2—7．6的PBS緩沖液)。固紫B鹽染色后BMSC胞核不著色，胞質(zhì)豐富，呈紫紅色，而其他細(xì)胞均無此染色特征；以固紅RC鹽、固紅GG鹽、固紅VR鹽、固紅ITR鹽、固藍(lán)B鹽、固藍(lán)RR鹽、固藍(lán)BB鹽、固紫醬GBC鹽染色作對比觀察，均未見陽性細(xì)胞；另外本方法簡便快速，整個操作過程僅需30min，染色明顯，對陳舊標(biāo)本也易著色，染色液配置后可較長時間保存，染色結(jié)果保留數(shù)月也不褪色。
參考文獻(xiàn)
[1]李順義，張靜，劉繼平，等．紡織染料耐曬黑G染色在血細(xì)胞研究中的應(yīng)用．中華血液學(xué)雜志，1993，14：595-596．
[2]郝冀洪，朱蕓，張靜，等．巨核細(xì)胞新染色方法及其臨床應(yīng)用研究．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2005．28：915-918．