背景^[1-3]

核酸組蛋白（小牛胸腺）以新鮮小牛胸腺組織為原料，經(jīng)乙醇和鹽酸提取后，經(jīng)透析、沉淀制備的產(chǎn)品。核酸組蛋白（小牛胸腺）水解后堿性氨基酸含量大于30%，全組蛋白包括五個電泳帶：H1、H2A、H2B、H3、H4。

核酸組蛋白（小牛胸腺）在遺傳學(xué)領(lǐng)域中用于組蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究中作標(biāo)準(zhǔn)和原料。

組蛋白（histone）是真核生物體細胞染色質(zhì)與原核細胞中的堿性蛋白質(zhì)，和DNA共同組成核小體結(jié)構(gòu)。它們是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)組分，作為DNA纏繞的線軸，并在基因調(diào)控中發(fā)揮作用，但是原核細胞組蛋白對基因調(diào)控的作用非常微弱。沒有組蛋白，染色體中未纏繞的DNA將非常長（人類DNA中的長寬比超過1000萬比1）。例如，每個人類二倍體細胞（含有23對染色體）具有約1.8米長的DNA，但是在組織蛋白上纏繞它具有約90微米（0.09毫米）的染色質(zhì)，當(dāng)在有絲分裂期間復(fù)制和濃縮時，其導(dǎo)致約120微米的染色體。

核酸組蛋白（小牛胸腺）

真核生物體細胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì)，含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸特別多，二者加起來約為所有氨基酸殘基的1/4。組蛋白與帶負電荷的雙螺旋DNA結(jié)合成DNA-組蛋白復(fù)合物。因氨基酸成分和分子量不同，主要分成5類。

組蛋白的甲基化修飾主要是由一類含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)來執(zhí)行的，組蛋白甲基化修飾參與異染色質(zhì)形成、基因印記、X染色體失活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種主要生理功能，組蛋白的修飾作用是表觀遺傳學(xué)研究的一個重要領(lǐng)域。組蛋白甲基化的異常與腫瘤發(fā)生等多種人類疾病相關(guān)，可以特異性地激活或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用對象不僅僅限于組蛋白，某些非組蛋白也可以被組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化，這將為探明細胞內(nèi)部基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、甚至個體的發(fā)育和分化機制提供更廣闊的空間。

組蛋白的基因非常保守。親緣關(guān)系較遠的種屬中，四種組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）氨基酸序列都非常相似，如海膽組織H3的氨基酸序列與來自小牛胸腺的H3的氨基酸序列間只有一個氨基酸的差異，小牛胸腺的H3的氨基酸序列與豌豆的H3也只有4個氨基酸不同。不同生物的H1序列變化較大，在某些組織中，H1被特殊的組蛋白所取代。如成熟的魚類和鳥類的紅細胞中H1則被H5所取代，精細胞中則由精蛋白代替組蛋白。染色質(zhì)中的組蛋白與DNA的含量之比為1:1。

真核生物細胞核中組蛋白的含量約為每克DNA 1克，大部分真核生物中有5種組蛋白，兩棲類、魚類和鳥類還有H5以替代或補充H1。染色質(zhì)是由許多核小體組成的，H2A，H2B，H3和H4各2個分子構(gòu)成的8聚體是核小體的核心部分，H1的作用是與線性DNA結(jié)合以幫助后者形成高級結(jié)構(gòu)。組蛋白是已知蛋白質(zhì)中最保守的，例如，人類和豌豆的H4氨基酸序列只有兩個不同，人類和酵母的H4氨基酸序列也只有8個不同，這說明H4的氨基酸序列在約10^9年間幾乎是恒定的。

應(yīng)用^[4][5]

核酸組蛋白（小牛胸腺）可以用于痕量銅離子檢測方法以及檢測組蛋白甲基化試紙條的構(gòu)建

基于具有催化活性的脫氧核糖核酸酶構(gòu)建了兩種用于銅離子檢測的生物傳感器,包括以DNA自組裝的非酶擴增熒光生物傳感器以及基于點擊化學(xué)和G四聚體的比色生物傳感器；以單鏈DNA標(biāo)記的膠體金為信號增強探針,構(gòu)建了一種新型的信號增強的試紙條生物傳感器,可用于組蛋白甲基化的快速檢測。

具體包括以下三方面的內(nèi)容：(1)利用自組裝的雙鏈DNA串聯(lián)體和SYBR GreenⅠ染色法構(gòu)建了非酶擴增的銅離子檢測方法。反應(yīng)機制基于銅離子能夠特異性地識別并切斷與銅離子依賴型DNA酶鏈雜交的底物鏈,釋放出的靶核酸能夠啟動DNA自組裝為長的雙鏈DNA,SYBR GreenⅠ染色后檢測熒光強度。實驗中,檢測信號的放大不需要使用蛋白酶,實驗操作簡單方便。對銅離子的檢測限為12.8pM,遠低于美國環(huán)境保護局規(guī)定的飲用水中允許量20gM。

(2) 利用基于點擊化學(xué)和具有辣根過氧化物酶活性的G四聚體的比色法構(gòu)建了一種銅離子快速檢測生物傳感器。在反應(yīng)體系中使用點擊化學(xué)使修飾有疊氮基團和炔基基團的兩條DNA序列形成G四聚體形成序列,之后加入高鐵血紅素和KCl,形成高鐵血紅素/G四聚體結(jié)構(gòu)。由于高鐵血紅素/G四聚體具有HRP的活性,能催化其無色底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine,TMB)形成有顏色的底物,實驗結(jié)果通過肉眼就能判別。定量分析時,將反應(yīng)終溶液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中,用酶標(biāo)儀讀取溶液在450nm的光密度(Optical density,OD)值。對銅離子檢測限為5.9nM,遠低于美國環(huán)境保護局規(guī)定的飲用水中銅離子濃度的允許濃度20μM。檢測體系簡單迅速,特異性好,不受其他物質(zhì)的干擾,結(jié)果肉眼可讀,適合在基層實驗室使用。

(3)使用核酸標(biāo)記的膠體金作為信號增強探針,構(gòu)建了一種信號增強的試紙條生物傳感器可用于組蛋白甲基化的快速、靈敏檢測。傳感器中用到了兩種帶有不同標(biāo)記的膠體金顆粒：包括標(biāo)記有單鏈DNA的金顆粒(信號增強探針)和同時標(biāo)記有單鏈c-DNA和單克隆抗體的金顆粒(雙標(biāo)金顆粒),其中DNA的序列與c-DNA互補。實驗時,首先通過雙抗夾心法捕獲蛋白,在檢測線上形成三明治夾心復(fù)合物的結(jié)構(gòu),即抗體-蛋白-雙標(biāo)的金顆粒,則檢測線因為膠體金顆粒的聚集而顯紅色。接著,再加入信號增強探針,這種金顆粒通過DNA和c-DNA的雜交而被固定在檢測線區(qū)域,此時有更多的膠體金聚集,檢測線的顯色被加深。HeLa細胞中的組蛋白H3K9m3(tri-methylated lysine9of histone H3)被選來作為信號增強的試紙條檢測的模型。實驗結(jié)果表明,此方法在20ng的HeLa細胞組蛋白提取液中就能檢測到H3K9me3,比傳統(tǒng)的試紙條和western blot的靈敏度分別提高了10倍和15倍。并且這種信號增強的試紙條生物傳感器具有普遍適用性,可以用來檢測其他類型的組蛋白甲基化,如單甲基化、二甲基化和三甲基化的H3K4和H3K9,以及各種不同的物質(zhì),如核酸,蛋白,病毒,微生物和小分子等。

參考文獻

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