背景[1-3]
新型PROTEIN A固定纖維素樹脂,用于抗體純化是一種新型Protein A的固定纖維素樹脂,Protein A經(jīng)過修飾后可以與免疫球蛋白Fc域特異性結合。使用這種新型Protein A,在溫和條件下即可洗脫抗體。強耐堿性和高抗體結合能力,可用于抗體純化。
新型PROTEIN A固定纖維素樹脂設計用于從生物液體和細胞培養(yǎng)基中簡易地一步純化免疫球蛋白,包括各個亞型IgG或者IgG片段。
新型PROTEIN A 固定纖維素樹脂
來源于大腸桿菌表達的重組ProteinA與天然ProteinA有著相同的功能,它含有4個可以和各個種屬IgG分子的Fc段高特異性結合的結構域。ProteinA是純化兔、豚鼠、狗和貓IgG的首選。Abbkine優(yōu)化的偶聯(lián)配方,確保了抗體產(chǎn)量,穩(wěn)定性以及可溶性的達到平衡。
ProteinA是一種來源于金黃色葡萄球菌的細胞壁蛋白,由五IgG結合區(qū)域組成,其分子量為42kDa。ProteinA能夠結合大多數(shù)免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域,也可以結合人類VH3家族的Fab區(qū)域。如果在血清中發(fā)生這樣的相互作用,IgG蛋白將會被錯誤的結合,細菌便借此擾亂了機體的調理素作用和正常生理機能。
抗體親和純化的基礎是protein G和protein A對不同物種IgG的Fc區(qū)域的高親和力和特異性。帶有固定在一些不同基質的protein G和protein A的層析介質,從而提供一種從腹水、細胞培養(yǎng)上清和血清中分離IgG和IgG亞類的卓越方法。
帶有重組protein L配體的層析介質用于抗體和抗體片段的純化。Protein L對kappa輕鏈的可變區(qū)有很強的親和力,能夠廣泛用于捕獲抗體片段比如Fab片段、單鏈可變區(qū)片段(scFv)和結合域抗體(Dabs)。
應用[4][5]
用于抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測體系的建立研究
通過獲得高質量雜交瘤細胞的基礎上,運用抗體重組技術獲得兔單克隆抗體,以使收集得到的兔單克隆抗體的免疫捕獲能力進一步提高最終建立一種檢測GNA蛋白的基于兔單克隆抗體雙抗夾心ELISA檢測體系。
其主要實驗內容和結果如下:(1)抗GNA兔多克隆抗體的制備及鑒定運用SDS-PAGE凝膠電泳對GNA免疫抗原蛋白的分子量和純度進行檢測。結果表明,GNA蛋白分子量約為14.3KDa,且純度較高,可作為獨立的抗原引起機體的免疫反應。用BCA蛋白檢測試劑盒測得GNA蛋白的濃度為1.64mg/mL。采用免疫技術,將GNA蛋白與等量弗氏完全佐劑乳化后注射入兩只兔子(B3365,B3366)體內。
經(jīng)五次免疫之后選擇免疫效價較高的兔子(B3366),取全血,經(jīng)Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化兔多抗血清,并對其純度和效價分別進行凝膠電泳和間接ELISA檢測。結果表明,所獲得的抗GNA兔多克隆抗體純度較高,幾乎不含其它雜蛋白,效價在8000~32000之間。
(2)抗GNA兔單克隆抗體的制備及鑒定免疫兩只兔子(B3365,B3366),選取效價較高的B3366號兔子的脾臟進入細胞融合階段。
(3)將兔子脾臟淋巴細胞與240E骨髓瘤細胞融合。運用間接ELISA法,經(jīng)過初篩復篩,獲得雙陽性克隆子6個(zju-17-2、zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6、zju-17-14、zju-17-17),取其中三個(zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6)進入抗體質粒重組階段,選取分泌單克隆抗體能力強且抗體親和性高的配對(zju-17-5(2L/2H)),進入單克隆抗體的大轉生產(chǎn),最后將收集到的抗GNA兔單克隆抗體經(jīng)Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化。
經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析,證實了該兔單克隆抗體的純度高,運用IgG檢測技術和間接ELISA檢測技術,分別獲得該目標抗體的初始濃度為2.28mg/mL,效價在32000~128000之間,親和常數(shù)為0.387×109L/mol。
參考文獻
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[3]Plant lectins as defense proteins against phytophagous insects[J].Gianni Vandenborre,Guy Smagghe,Els J.M.Van Damme.Phytochemistry.2011(13)
[4]Pyramided rice lines harbouring Allium sativum(asal)and Galanthus nivalis(gna)lectin genes impart enhanced resistance against major sap-sucking pests[J].Y.Bharathi,S.Vijaya Kumar,I.C.Pasalu,S.M.Balachandran,V.D.Reddy,K.V.Rao.Journal of Biotechnology.2011(3)
[5]沈金兒.抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測體系的建立[D].浙江大學,2013.