背景^[1-3]

ACAA1抗體是一種可以特異性結合ACAA1的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的ACAA1蛋白。ACAA1抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。

ACAA1抗體（C-8）既有非偶聯(lián)型抗ACAA1抗體形式，也有多種偶聯(lián)型抗ACAA1抗體形式，包括瓊脂糖、HRP、PE、FITC和多種Alexa Fluor?偶聯(lián)物。哺乳動物組織含有五種硫解酶，它們都參與體內(nèi)各種化合物的代謝。ACAA1（乙酰輔酶A?；D移酶1），也稱為過氧化物酶體3-氧代酰基輔酶A硫解酶，是硫解酶家族酶的424個氨基酸成員，參與脂質代謝。ACAA1定位于過氧化物酶體，在脂肪酸氧化途徑中催化?；o酶A和乙酰輔酶A轉化為3-氧代酰基輔酶A。ACAA1在大鼠的肝、腎、腸和白色脂肪組織中顯示出高酶活性，存在A型和B型兩種類型。人類ACAA1與其大鼠對應物具有86%的氨基酸同一性，這表明ACAA1在不同物種間具有保守功能。

ACAA1抗體

ACAA1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。

3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（ACAA1抗體按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(ACAA1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應用^[4][5]

ACAA1抗體可以用于喉鱗狀細胞癌中脂肪酸代謝相關基因ADRP和ACAA1異常表達的研究

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,其中絕大多數(shù)為喉鱗狀細胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC),近年來其發(fā)病率呈上升趨勢,其發(fā)病機制尚不甚清楚,因此學者們致力于探索喉癌發(fā)生發(fā)展機制。腫瘤細胞能量代謝改變?nèi)鏦arburg效應在腫瘤增殖、調亡、轉移等方面發(fā)揮重要作用。脂肪酸是能量代謝的重要底物,腫瘤細胞中脂肪酸代謝呈異常激活狀態(tài),脂肪酸代謝相關基因表達水平的改變可能影響腫瘤細胞的生物學行為。

探討喉鱗狀細胞癌中脂肪酸代謝機制,我們開展本課題研究即脂肪酸代謝相關基因脂肪相關分化蛋白(Adipose differentiation-related protein,ADRP)和乙酰輔酶A?；D移酶(Acetyl CoA acyltransferase 1,ACAA1)基因在LSCC中的表達特點,分析其表達與臨床病理參數(shù)的關系,為進一步的實驗研究提供理論基礎。研究方法1.通過實時熒光定量PCR方法檢測LSCC中的ADRP和ACAA1基因的轉錄水平。2.通過用ACAA1抗體免疫組織化學染色法從蛋白水平檢測LSCC中ADRP和ACAA1的異常表達。3.結合LSCC樣本的臨床特征,分析脂肪酸代謝基因ADRP和ACAA1與喉癌發(fā)生發(fā)展的關系。

ACAA1抗體研究結果1.檢測發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織,ADRP和ACAA1在LSCC中轉錄水平下調。2.LSCC中ADRP和ACAA1的蛋白水平呈明顯表達下調。3.ADRP和ACAA1的表達與LSCC的TNM分期、分化程度有關。研究結論脂肪酸代謝相關基因ADRP和ACAA1在LSCC中異常表達,此外與LSCC的TNM分期、病理分級有關,提示了ADRP和ACAA1的異常表達可能參與LSCC的發(fā)生發(fā)展過程,為探索LSCC的發(fā)生機制提供新的思路。

參考文獻

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