背景^[1-3]

VAMP2抗體是一種可以特異性結(jié)合VAMP2的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的VAMP2蛋白。VAMP2抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。

VAMP2，即囊泡相關(guān)膜蛋白2，別名synaptobrevin-2。它是一種在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，主要在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達。VAMP2作為可溶性細胞膜的關(guān)鍵成分之一，參與形成SNARE（可溶性細胞膜因子附著蛋白受體）復合體，與syntaxin-1A和SNAP-25結(jié)合產(chǎn)生誘導融合孔形成的力量，從而介導突觸小泡的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。VAMP2在生物學上的意義非常重大，它不僅參與神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放，影響神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞，還與多種神經(jīng)退行性疾病和精神疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。VAMP2的活性受到多種因素的精細調(diào)控，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝離子等。研究表明，VAMP2在不同區(qū)域的突觸小泡膜上展現(xiàn)出不同的構(gòu)象，膽固醇豐富的微域?qū)ζ錁?gòu)象和SNARE組裝有重要影響。此外，VAMP2的膜結(jié)合特性和活性狀態(tài)在突觸前細胞質(zhì)中受到嚴格調(diào)控，這對于神經(jīng)遞質(zhì)釋放的時空精度至關(guān)重要。

VAMP2抗體

VAMP2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（VAMP2抗體按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(VAMP2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應用^[4][5]

VAMP2抗體可以用于Rab10 Thr73位點磷酸化在腦內(nèi)的生理作用研究

研究目的:1.探討Rab10 Thr73位點磷酸化對小鼠行為學表型的影響;2.探討Rab10 Thr73位點磷酸化影響的主要腦區(qū)和細胞類型;3.探討Rab10 Thr73位點磷酸化對腦內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)、功能的影響及其分子機制。

研究方法:1.構(gòu)建模擬Rab10持續(xù)非磷酸化和持續(xù)磷酸化狀態(tài)的小鼠模型利用CRISPR/Cas9技術(shù),分別構(gòu)建模擬Rab10持續(xù)非磷酸化狀態(tài)和持續(xù)磷酸化狀態(tài)的Rab10 T73V和T73D突變小鼠模型,并利用DNA測序、免疫蛋白印跡(Western Blot,WB)對Rab10的突變和表達水平進行了驗證。

2.檢測Rab10突變小鼠的行為學表型對3月齡Rab10T73V/T73V小鼠和3月齡、5月齡、7月齡和9月齡Rab10T73D/+小鼠及同窩Rab10+/+小鼠進行一系列的行為學檢測,包括:曠場試驗、高架十字迷宮試驗、明暗箱試驗、Y迷宮試驗、○迷宮試驗、T迷宮試驗、藏寶試驗、筑巢試驗、巴恩斯迷宮、加速旋轉(zhuǎn)桿試驗、懸尾試驗、強迫游泳試驗、條件性恐懼試驗、代謝籠和新物體識別試驗,用以檢測小鼠自發(fā)活動度、焦慮樣行為、重復性強迫樣行為、學習記憶、抑郁樣行為、運動協(xié)調(diào)能力和能量代謝等方面的表型。

3.檢測Rab10突變小鼠突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變提取Rab10+/+及Rab10T73V/T73V小鼠紋狀體、杏仁核、背側(cè)海馬、腹側(cè)海馬和前額葉皮層這5個與焦慮行為相關(guān)的腦區(qū)蛋白,VAMP2抗體WB檢測VAMP1、VAMP2、Syntaxin 1、SHANK2、Synaptophysin、PSD95等突觸蛋白的表達水平,確定Rab10 T73V突變影響的主要腦區(qū)。再對實驗中確定的責任腦區(qū)——紋狀體進行針對性檢測:利用腦片膜片鉗,記錄中型棘突神經(jīng)元(medium spiny neuron,MSN)微小抑制性突觸后電流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)和微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC),以檢測突觸功能;利用透射電鏡觀察突觸密度、突觸小泡的密度和直徑、突觸后致密斑的長度和寬度;對紋狀體腦區(qū)進行抑制性突觸前、后標志物GAD67和Gephyrin,興奮性突觸前、后標志物VGLUT1和PSD95的免疫熒光染色,分析抑制性突觸和興奮性突觸的密度。

參考文獻

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[2]The Regulation of Rab GTPases by Phosphorylation[J].Xu Lejia;Nagai Yuki;Kajihara Yotaro;Ito Genta;Tomita Taisuke.Biomolecules.2021

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[5]張菁.Rab10 Thr73位點磷酸化在腦內(nèi)的生理作用研究[D].山東大學,2023.