背景^[1-3]

BNIP3L抗體是一種可以特異性結(jié)合BNIP3L的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的BNIP3L蛋白。BNIP3L抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

BNIP3L，也稱為Nix，是一種位于外膜的線粒體蛋白，屬于BCL2家族中僅BH3的蛋白。BNIP3L最初被認(rèn)為具有促凋亡作用，與其他家族成員相比，它表現(xiàn)出較溫和的凋亡功效。其主要作用包括在網(wǎng)織紅細(xì)胞發(fā)育過程中清除線粒體。BNIP3L作為線粒體自噬受體發(fā)揮作用，與Atg8蛋白結(jié)合，尤其是通過缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1A)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而由缺氧誘導(dǎo)。這使得BNIP3L介導(dǎo)的線粒體自噬成為對缺氧應(yīng)激的典型反應(yīng)。

BNIP3L抗體

BNIP3L抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（BNIP3L抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(BNIP3L抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

BNIP3L抗體可以用于功能磁共振成像在評估對比劑誘導(dǎo)鼠急性腎損傷中的應(yīng)用及其發(fā)病機(jī)制與2型糖尿病關(guān)系的研究

關(guān)于CI-AKI的發(fā)生機(jī)制研究大多集中在氧化應(yīng)激和對比劑毒性作用所帶來的腎小管上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷上,很少有關(guān)于免疫反應(yīng)在CI-AKI的研究,腎臟細(xì)胞的損傷途徑也沒有完全清楚。此外,有不少研究發(fā)現(xiàn)糖尿病(DM)和(或)糖尿病腎病(DN)是CI-AKI的危險(xiǎn)因素,其中的機(jī)制尚不明確。最后,由于目前還沒有一種可以無創(chuàng)檢測和預(yù)測CI-AKI的方法,臨床上發(fā)現(xiàn)CI-AKI時BUN和sCr已經(jīng)升高,腎功能已經(jīng)進(jìn)一步下降。與傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)磁共振成像相比,功能磁共振成像(fMRI)可以反映組織器官的功能情況,fMRI可能為CI-AKI的檢測提供新的方法和思路。

目的1.探索CI-AKI發(fā)生的免疫機(jī)制及其中可能出現(xiàn)的不同細(xì)胞損傷和死亡方式;2.探索DM如何成為CI-AKI危險(xiǎn)因素;3.探索fMRI評估CI-AKI的方法;4.總結(jié)CI-AKI的發(fā)生機(jī)制及闡述其與DM的關(guān)系。方法第一部分1.磁共振圖像獲取和CI-AKI模型建立:共計(jì)18只雄性C57BL/6小鼠編號(01-18),異氟烷麻醉,用9.4T磁共振的不同序列(T1WI,T2WI,DTI和BOLD)對小鼠腎臟進(jìn)行掃描;禁食、禁飲24h后通過尾靜脈給其中15只小鼠注射碘克沙醇320,劑量4 g(I)/kg,建立C57BL/6小鼠CI-AKI模型,另外3只注射等量生理鹽水,在注射對比劑后的五個不同時間內(nèi)(1,12,24,48,72 h)用9.4T磁共振的不同序列(如前)掃描小鼠腎臟(每個時間3只,生理鹽水3只)。2.圖像分析:觀察小鼠腎臟的圖像特征;用軟件ImageJ獲取圖像ROIs并進(jìn)行灰度值測量。3.取材:處死所有小鼠,右腎用4%多聚甲醛固定,后續(xù)制作腎臟冠狀位石蠟切片,左腎-80℃保存,后續(xù)提取蛋白;收集血液離心,取血清-80℃保存。4.獲取微觀圖像:石蠟切片制作和H&E染色,顯微鏡下觀察小鼠腎臟微觀結(jié)構(gòu)變化并評估腎臟損傷情況,進(jìn)行組織學(xué)評分。5.免疫組化染色:用Ly6G和Nlrp3抗體對小鼠腎臟石蠟切片行免疫組化染色,顯微鏡下評估染色情況,做H-score評分。6.對磁共振圖像的灰度值和組織病理學(xué)評分進(jìn)行相關(guān)性分析。7.用ELISA分析小鼠血清NGAL。8.用BNIP3L抗體Western Blot分析小鼠腎臟某些蛋白(Nlrp3,NF-κB,cas8,casl,BNIP3L/Nix,Bc12,BAX,CytoC,GAPDH)的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1]The Application of Functional Magnetic Resonance Imaging in Type 2 Diabetes Rats With Contrast-Induced Acute Kidney Injury and the Associated Innate Immune Response[J].Li Yanfei;Shi Dafa;Zhang Haoran;Yao Xiang;Wang Siyuan;Wang Rui;Ren Ke.Frontiers in Physiology.2021

[2]Contrast-induced nephropathy and oxidative stress:mechanistic insights for better interventional approaches.[J].Kusirisin Prit;Chattipakorn Siriporn C;Chattipakorn Nipon.Journal of translational medicine.2020

[3]Interplay Between NLRP3 Inflammasome and Autophagy.[J].Biasizzo Monika;KopitarJerala Nata?a.Frontiers in immunology.2020

[4]Hypoxia inducible factors and diabetes.[J].Gunton Jenny E.The Journal of clinical investigation.2020

[5]李彥飛.功能磁共振成像在評估對比劑誘導(dǎo)鼠急性腎損傷中的應(yīng)用及其發(fā)病機(jī)制與2型糖尿病關(guān)系的研究[D].廈門大學(xué),2022