背景及概述^[1][2]

右旋糖酐40，又叫低分子右旋糖酐，本品可提高血漿參透壓而增加血漿容量。有改善微循環(huán)作用，能防止彌漫性血管內(nèi)凝血，使靜脈回流量和心搏出量增加，具有滲透性利尿作用。

制備^[2]

CN201410003338.2提供一種右旋糖酐酶的制備方法及其在制備低分子量右旋糖酐中的應(yīng)用。 本發(fā)明提供一種從土壤中篩選出的高酶活右旋糖酐酶產(chǎn)生菌-棘孢青霉，該菌株保藏名稱為：棘孢青霉F1008，保藏單位：中國微生物菌種保藏中心。 本發(fā)明運(yùn)用棘孢青霉F1008發(fā)酵培養(yǎng)制得高活性的右旋糖酐酶，其制備步驟包括：

1）菌株活化：采用滅菌固體PDA培養(yǎng)基，將F1008菌株接種在試管斜面上，30-32℃下培養(yǎng)48-60h，然后用于菌株種子液制備；

2）菌株種子發(fā)酵培養(yǎng)：種子培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，將步驟1）中的菌株接種到所述的種子培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床上30-32℃，轉(zhuǎn)速220r/min下培養(yǎng)48-72小時(shí)作為種子液，然后將種子液用于發(fā)酵制備右旋糖酐酶；

3）發(fā)酵制備右旋糖酐酶：發(fā)酵培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，利用滅菌后發(fā)酵培養(yǎng)基，將步驟2）中的種子液按5%的比例接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床上30-32℃，轉(zhuǎn)速220r/min下培養(yǎng)5天得到相應(yīng)的右旋糖酐酶的發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液用于分離純化；

4）右旋糖酐酶的分離純化：將步驟3）中得到的右旋糖酐酶的發(fā)酵液通過過濾、離心分離菌體，然后再進(jìn)行硫酸銨鹽析以及瓊脂糖凝膠柱分離，得到純的右旋糖酐酶酶液，運(yùn)用DNS法測定酶活力。

5）右旋糖酐酶優(yōu)先降解高分子右旋糖酐的特性：將步驟4）中得到的純酶液與兩種不同分子量右旋糖酐（底物E分子量Mw34242Da，底物F分子量Mw6655Da）構(gòu)成的雙底物溶液進(jìn)行混合，在25℃下催化反應(yīng)，運(yùn)用HPLC檢測催化過程中兩種底物的分子量變化，結(jié)果見圖1，高分子量的底物E優(yōu)先被降解，分子量不斷降低，而低分子量的底物F在反應(yīng)初期基本無變化，從而證實(shí)本發(fā)明公開的棘孢青霉F1008右旋糖酐酶具有優(yōu)先降解高分子右旋糖酐的特性。

本發(fā)明公開的棘孢青霉F1008能夠產(chǎn)生高酶活性的右旋糖酐酶，該右旋糖酐酶的特征在于它的最適作用溫度為25～35℃，最適催化pH為5.0～6.0，其平均酶活高于600U/mL，并且該右旋糖酐酶在多底物溶液中優(yōu)先選擇與高分子量的底物反應(yīng)，非常適用于低分子量右旋糖酐的制備。

本發(fā)明公開棘孢青霉F1008右旋糖酐酶在制備系列低分子右旋糖酐中的應(yīng)用，其方法按如下步驟進(jìn)行：

按1000mL的反應(yīng)體系計(jì)算，首先將60-200g的蔗糖溶解于pH5.00.02mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，在25℃下同時(shí)添加2000-3000U的市售右旋糖酐蔗糖酶與2500-7500U的右旋糖酐酶，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)22-26小時(shí)；然后將反應(yīng)體系置于80℃下保溫1小時(shí)滅活右旋糖酐蔗糖酶，紗布濾過變性酶蛋白后再置于沸水浴中20分鐘滅活殘留的右旋糖酐酶，再經(jīng)真空過濾得到清澈透明的濾液，即為系列低分子右旋糖酐溶液；

最后將該溶液進(jìn)行旋蒸濃縮70℃旋蒸濃縮去除部分水分，濃縮至原體積一半后進(jìn)行分級(jí)醇沉，采用四級(jí)劃分：一級(jí)乙醇濃度為48，得到的沉淀為殘余蛋白雜質(zhì)及少量高分子糖酐；二級(jí)乙醇濃度為58，得到的沉淀為10000Da的右旋糖酐；三級(jí)乙醇濃度為68，得到的沉淀物為6000-8000Da的右旋糖酐；四級(jí)乙醇濃度為78，得到的沉淀物為3000-5000Da的右旋糖酐；每級(jí)得到的沉淀置于80℃真空干燥箱中干燥4小時(shí)，即得到系列低分子右旋糖酐純品。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

棘孢青霉F1008發(fā)酵培養(yǎng)成本低，所產(chǎn)的右旋糖酐酶具有高酶活、高的底物特異性、多底物溶液中優(yōu)先與高分子量的底物反應(yīng)、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，在與右旋糖酐蔗糖酶組成的雙酶體系中能夠及時(shí)優(yōu)先降解右旋糖酐蔗糖酶合成出的大分子量右旋糖酐，從而累積低分子右旋糖酐的量，非常適用于工業(yè)化運(yùn)用，利用該酶與市售右旋糖酐蔗糖酶聯(lián)合催化蔗糖制備系列低分子量右旋糖酐的反應(yīng)條件溫和、能耗低，工序簡單；通過調(diào)節(jié)雙酶體系的工藝參數(shù)（蔗糖濃度、雙酶用量、反應(yīng)時(shí)間），可以實(shí)現(xiàn)對右旋糖酐分子量的調(diào)控；通過后期對反應(yīng)液進(jìn)行的濃縮處理，醇沉過程的無水乙醇用量大大減少，從而使得生產(chǎn)成本進(jìn)一步降低；雙酶催化得到的右旋糖酐分子量分布集中、種類多（10000Da，6000-8000Da，3000-5000Da），總收率高；本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)低分子右旋糖酐生產(chǎn)工藝低成本化、 環(huán)保、低碳、產(chǎn)率提高的目標(biāo)，為酶法生產(chǎn)右旋糖酐的工業(yè)化奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

藥代動(dòng)力學(xué)^[2]

平均分子量約為40000。因分子小，在體內(nèi)停留時(shí)間短，易從尿中排出，故擴(kuò)充血容量的作用較為短暫。

臨床應(yīng)用^[2]

用于急性失血性休克、心絞痛、心肌梗死，以及腦血栓形成、腦供血不足、血栓閉塞性脈管炎等。 

不良反應(yīng)^[2]

①少數(shù)患者發(fā)生過敏反應(yīng)：發(fā)熱、寒戰(zhàn)、胸悶、呼吸困難等;②用量超過1 000ml時(shí)，少數(shù)患者出血時(shí)間延長。

注意事項(xiàng)^[2]

①用藥前取0.1 ml作皮內(nèi)注射，觀察15min;②充血性心力衰竭及其他血容量過多，有出血傾向者忌用;③肝、腎功能不全慎用。

主要參考資料

[1] 實(shí)用處方及非處方藥物大全

[2] CN201410003338.2 一種右旋糖酐酶及其在制備低分子右旋糖酐中的應(yīng)用