背景及概述[1]
葡聚糖，又稱右旋糖酐，是指以葡萄糖為單糖組成的同型多糖。葡聚糖鏈長短的不同決定了其藥用價值不同，長鏈葡聚糖通常為血容量擴(kuò)充藥，分子量在幾萬到十幾萬；而短鏈葡聚糖可以與氫氧化鐵進(jìn)行絡(luò)合，制成葡聚糖鐵，即右旋糖酐鐵。
葡聚糖是蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶(dextransucraseEC2.4.1.5)催化合成的高分子葡萄糖聚合物，該聚合物含有95％的α?1，6糖苷鍵，同時含有少量其他糖苷鍵的分支結(jié)構(gòu)。因其具有安全、無毒等多種優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和工業(yè)等多個領(lǐng)域。高分子右旋糖酐可以用作藥物載體，以及常用的凝膠色譜填料。臨床上常用的右旋糖酐有三種規(guī)格：右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20，它們主要用作血漿代用品，用于出血性休克、創(chuàng)傷性休克及燒傷性休克等。重均分子量6?8kDa的右旋糖酐常被制成右旋糖酐鐵，用于治療嚴(yán)重的貧血癥。重均分子量5kDa的右旋糖酐常被硫酸化，用于治療血栓。低分子異麥芽糖近來被發(fā)現(xiàn)，可用作益生元。作為一種來源豐富的多糖，右旋糖酐是食品工業(yè)中的優(yōu)良配料，主要用作保濕劑、穩(wěn)定劑、增量及和增稠劑。在工業(yè)上，右旋糖酐被用作為油井鉆泥的添加劑。
制備[1-2]
報道一、
發(fā)酵法結(jié)合酶法制備分子量可控的藥用葡聚糖，按如下步驟進(jìn)行：
(1)腸膜狀明串珠菌發(fā)酵合成高分子葡聚糖，包含以下A、B兩步：
A：培養(yǎng)基配制
種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖100，蛋白胨2.5，Na2HPO4·12H2O1.8；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡聚糖70(1)15.0，蛋白胨5.0，K2HPO4·3H2O1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01，KCl0.5，MgSO4·7H2O0.5，用NaOH調(diào)pH至7.4；在0.1MPa壓力下，滅菌20min。
B：腸膜狀明串珠菌發(fā)酵合成高分子葡聚糖
在無菌環(huán)境下，將腸膜狀明串珠菌以5.0％的接種量轉(zhuǎn)接到分別裝有100mL種子培養(yǎng)基的3個搖瓶中，于25℃，120r/min條件下培養(yǎng)22h。然后以5.0％的接種量轉(zhuǎn)接到裝有5.0L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于25℃，120r/min條件下發(fā)酵22h。出料時，向發(fā)酵液中加入85％的乙醇使發(fā)酵液中乙醇的體積濃度為35％～38％，葡聚糖沉淀后，再經(jīng)85％乙醇捏洗至“老化”。蔗糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)95％，該步驟糖酐收率在85％～90％。
(2)高分子葡聚糖的糊化
將上述步驟1)獲得的750.48g濕糖酐用蒸餾水按照濕糖酐與緩沖溶液按照1∶1.8(w/V)配制成高分子葡聚糖溶液，在90度條件下保溫12小時，標(biāo)定高分子葡聚糖的濃度為11％時添加55.41mL蒸餾水。
(3)葡聚糖酶催化水解高分子葡聚糖
葡聚糖酶的活力測定：將4mL用蒸餾水配制的3.0％葡聚糖70kDa溶液置于35度保溫10min，再加入適當(dāng)稀釋的葡聚糖酶液1mL保溫1小時后，采用3，5?二硝基水楊酸(DNS)法測定生成的還原糖。以上述條件下酶分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖(葡萄糖當(dāng)量)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。檢測結(jié)果所示葡聚糖酶液活力為300U/mL。
向步驟2)經(jīng)濃度標(biāo)定后為11％的高分子葡聚糖溶液中加入葡聚糖酶使其終濃度為0.5IU/mL，加入的葡聚糖酶總活力單位為971.5U，置于35℃條件下攪拌反應(yīng)130～150min，然后采用100度水浴保溫10min或通入水蒸氣5min的方法，是葡聚糖酶變性失活，從而終止酶催化反應(yīng)。
(4)去除雜質(zhì)
將上述步驟3)經(jīng)葡聚糖酶催化水解的反應(yīng)液置于80℃保溫30min，冷卻后采用中速定性濾紙過濾，然后將上述濾液采用活性炭攪拌吸附10min后，靜置10min，再利用中速定性濾紙去除活性炭等，清澈透明的濾液用于右旋糖酐分離醇沉。
(5)乙醇分級醇沉及真空干燥
采用4級劃分，一級劃分乙醇體的積濃度為38％，在攪拌裝置下，向步驟4)所得濾液中加入緩慢體積濃度95％的乙醇，根據(jù)濾液溫度和酒精度值查表的濾液中酒精的體積濃度，當(dāng)乙醇的體積濃度達(dá)到39％時停止醇沉，將醇沉好的溶液置于40度保溫22h后，倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇，取出一級沉淀大分子雜質(zhì)；二級劃分乙醇的體積濃度為43％，向一級劃分后的上清液緩慢加入95％的乙醇，具體操作同上，使溶液中乙醇的體積濃度達(dá)到42％時，停止醇沉，將醇沉好的溶液置于34度保溫22h后，倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇獲得葡聚糖70產(chǎn)品；三級劃分乙醇的體積濃度為47％，向二級劃分后的上清液中緩慢加入95％的乙醇，具體操作同上，使溶液中乙醇體積濃度達(dá)到48％時停止醇沉，將醇沉好的溶液置于40度保溫12h后，倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇獲得葡聚糖40產(chǎn)品；四級劃分乙醇濃度為58％，向三級劃分后的上清液中緩慢加入95％的乙醇，使溶液中乙醇體積濃度達(dá)到58％時停止醇沉，將醇沉好的溶液置于室溫靜置2h后，倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇獲得葡聚糖20產(chǎn)品。
將上述的葡聚糖產(chǎn)品分別置于80℃真空干燥箱中干燥4h，去除產(chǎn)品中殘留的乙醇及水分，最后得到三種不同分子量的藥用級葡聚糖，經(jīng)搞笑液相色譜檢測，三種產(chǎn)品的分子量分別是68574，39821和21053Da，保留時間分別為13.926min，14.327min和15.054min，分子量分布系數(shù)分別為1.86、1.40和1.23，酶解劃分收率為85.35％，對應(yīng)的產(chǎn)率為15.20％、60.49％和9.67％。當(dāng)反應(yīng)時間為130～150min，可以定向制備葡聚糖40為主要的產(chǎn)品。
報道二、
一種生產(chǎn)小分子葡聚糖的方法，具體步驟如下：
(1)將pH＝5、濃度為0.01g/L的葡聚糖酶溶液加入截留分子量為10000Da的聚丙烯腈卷式超濾膜系統(tǒng)中，在操作壓力1.0MPa、溫度30℃下進(jìn)行過濾濃縮處理，使得葡聚糖酶2完全吸附在超濾膜3的表面或膜孔內(nèi)；得到酶膜反應(yīng)器；
(2)在步驟(1)所得酶膜反應(yīng)器中加入pH＝5.5、濃度為100g/L、重均分子量為20000Da的葡聚糖原料1的溶液，在操作壓力為0.6MPa，溫度為50℃下進(jìn)行過濾，收集透過液中的小分子葡聚糖產(chǎn)物4，測得其平均分子量為4500Da，分子量分布寬度指數(shù)為1.8。而在同樣條件下，采用分體式酶膜反應(yīng)器，葡聚糖酶6沒有起到調(diào)控膜孔徑的作用，葡聚糖原料5酶解后通過超濾膜7后獲得小分子葡聚糖產(chǎn)物8，其平均分子量為5600Da，分子量分布寬度指數(shù)為2.8，與小分子葡聚糖產(chǎn)物4相比，分子量分布寬度指數(shù)增加，平均分子量增大。
(3)待膜通量或產(chǎn)率下降50％以上，將超濾系統(tǒng)內(nèi)的料液頂出，加入0.1％的氫氧化鈉溶液在40℃下清洗1小時，將超濾膜系統(tǒng)沖洗干凈后再加入0.2％的檸檬酸清洗1小時，然后重新進(jìn)行葡聚糖酶的固定化和酶解分離。與傳統(tǒng)的分批酶解-滅活-超濾膜分離的方法相比，本方法進(jìn)行葡聚糖酶解和分離獲得的產(chǎn)率提高20％，葡聚糖酶使用量減少60％，產(chǎn)品純度提高30％。
參考文獻(xiàn)
[1][中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)]CN201310247228.6制備分子量可控的藥用葡聚糖的方法
[2][中國發(fā)明]CN201711285656.2一種生產(chǎn)小分子葡聚糖的方法及其產(chǎn)品和用途