鎳柱
親和層析技術(shù)的基本原理在于，它依賴于分子間獨(dú)特的、高度特異性的相互作用，這些相互作用使得分子間能夠形成既專一又可逆的結(jié)合，這種力量我們稱之為親和力。
在生物科學(xué)中，存在多種具有專一性親和力的生物分子對(duì)，例如：
酶與基質(zhì)類似物、抑制劑或輔酶之間；
抗體與抗原、病毒或細(xì)胞之間；
細(xì)胞與其表面的特異蛋白、外源凝集素之間；
核酸與互補(bǔ)堿基序列、組蛋白或核酸聚合酶之間；
激素或藥物與受體、載體蛋白之間；
外源凝集素與多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體或細(xì)胞之間。
在親和層析過程中，那些能夠與待分離物質(zhì)特異性結(jié)合的分子被固定在色譜基質(zhì)上，這些被固定的分子被稱為配體。配體與基質(zhì)之間通過共價(jià)鍵緊密相連，共同構(gòu)成了親和層析的固定相，也被稱為親和吸附劑。為了構(gòu)建這種親和吸附劑，配體首先需要通過共價(jià)鍵與經(jīng)過活化的基質(zhì)相結(jié)合，從而形成固相載體。常用的載體材料包括瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠以及纖維素等，它們?yōu)橛H和層析提供了穩(wěn)定且高效的分離平臺(tái)。
咪唑環(huán)，作為一種五元雜環(huán)化合物，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有一個(gè)1,3-二氮雜環(huán)，英文表述為Imidazole。若從咪唑環(huán)上位于第一位或第三位的氮原子上移除與之直接相連的氫原子，所得的部分則被稱作咪唑基團(tuán)。簡而言之，咪唑基團(tuán)是咪唑分子中去除一個(gè)與氮原子直接相連的氫原子后剩余的結(jié)構(gòu)片段。
組氨酸的特性在于其輕微的疏水性以及咪唑環(huán)所賦予的微弱電性。
多種過渡金屬離子，如Cu²?、Ni²?、Zn²?、Co²?等，能與N、S、O等供電子原子形成配位鍵，進(jìn)而與蛋白質(zhì)表面的特定基團(tuán)如組氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巰基以及色氨酸（Trp）的吲哚基發(fā)生強(qiáng)烈的親和性結(jié)合，其中咪唑基與金屬離子的結(jié)合尤為牢固。這些金屬離子與咪唑基的結(jié)合力按照Cu²?、Ni²?、Zn²?、Co²?的順序遞減。
鎳離子具有六個(gè)潛在的螯合位點(diǎn)。在鎳柱的應(yīng)用中，根據(jù)螯合位點(diǎn)的不同，鎳柱被分為Ni-NTA和Ni-IDA兩種類型。Ni-NTA螯合了四個(gè)位點(diǎn)，留下兩個(gè)空位；而Ni-IDA則螯合了三個(gè)位點(diǎn)，剩余三個(gè)空位。因此，Ni-IDA Agarose的結(jié)合能力相對(duì)更強(qiáng)，能夠在相同條件下承載更多的蛋白質(zhì)，但需要使用更高濃度的咪唑來洗脫雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白。然而，Ni-NTA在穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出優(yōu)勢，更能耐受強(qiáng)還原劑的作用，鎳離子不易脫落。因此，在選擇鎳柱時(shí)，需要根據(jù)具體的純化條件進(jìn)行權(quán)衡，以達(dá)到最佳的純化效果。
基質(zhì)特性概述：
基質(zhì)是一種具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性材料，其滲透性能優(yōu)異。它具備高度的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠承受較大的機(jī)械應(yīng)力，從而確保較長的使用壽命。此外，基質(zhì)還能有效抵抗微生物和酶的侵蝕，保持其結(jié)構(gòu)的完整性。理想的基質(zhì)應(yīng)具有均勻的球形粒子，以提高分離效率。同時(shí)，基質(zhì)應(yīng)具有親水性，避免非特異性吸附，且含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，便于親和配體的固定。
瓊脂糖凝膠微球?qū)嵗?/strong>：
瓊脂糖凝膠微球，商品名為Sepharose，根據(jù)其含糖濃度的不同，分為2B、4B和6B三種類型。其中，Sepharose 4B的結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，吸附容量適中，因此在實(shí)際應(yīng)用中最為廣泛。
配基的選擇原則：
配基是一種能夠可逆結(jié)合特定分子或基團(tuán)的分子，是親和色譜純化的關(guān)鍵。選擇配基時(shí)，需考慮其特異性和可逆性，確保與目標(biāo)物能夠穩(wěn)定結(jié)合并易于分離。同時(shí)，配基應(yīng)具有化學(xué)修飾基團(tuán)，便于吸附在基質(zhì)上，且不影響其活性。
間隔臂的作用與選擇：
當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)位于分子內(nèi)部時(shí)，直接偶聯(lián)配基可能受到空間位阻的影響，導(dǎo)致結(jié)合能力降低。此時(shí)，可在配基與基質(zhì)之間插入一個(gè)間隔臂，以提高結(jié)合效率。間隔臂的長度需適中，過短可能無效，過長則可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合。一般來說，當(dāng)偶聯(lián)的分子量較小時(shí)，需要使用間隔臂；而當(dāng)分子量較大時(shí)，則不一定需要。
二硫鍵在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的作用：
二硫鍵是蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基之間形成的共價(jià)鍵，對(duì)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)起著重要作用。為了確定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，需要打開二硫鍵，使其變?yōu)榫€狀多肽鏈。
親和層析的上樣與洗脫方式：
上樣方式包括直接上樣和間接上樣兩種。洗脫方式則根據(jù)配基和目標(biāo)物的性質(zhì)而定，包括pH值洗脫、離子強(qiáng)度洗脫和競爭性洗脫（如使用咪唑）。
親和層析柱的再生步驟：
為了恢復(fù)親和層析柱的性能，需要進(jìn)行再生處理。具體步驟包括：首先用強(qiáng)變性劑（如6M鹽酸胍）沖洗柱子以去除殘留的蛋白質(zhì)；然后用水沖洗干凈；接著用0.2%SDS沖洗柱子以去除殘留的變性劑；再次用水沖洗干凈；之后用50%乙醇沖洗柱子以去除SDS；再次用水沖洗干凈；然后用含有Tris和EDTA的緩沖液（如100mM EDTA, 50mM Tris, pH 8.0）沖洗柱子以去除金屬離子；再次用水沖洗干凈；最后用100mM硫酸鎳孵育柱子以重新固定鎳離子；最后以20%乙醇保存柱子于4℃環(huán)境中備用。
上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司
試劑 | 耗材 | 儀器 | 軟件 | 定制 | 實(shí)驗(yàn)服務(wù) | 供應(yīng)鏈
免費(fèi)熱線：4008-168-068
咨詢郵箱：info@univ-bio.com
訂購商城：www.univ-bio.com
微信公眾平臺(tái)：優(yōu)寧維抗體專家，歡迎關(guān)注！
小優(yōu)博士（小程序）：5大課堂, 讓你的科研不再難！
