羧肽酶B是一種外分泌蛋白酶, 屬于金屬羧肽酶A和羧肽酶B (CPA/CPB) 家族, 每分子含有一個(gè)Zn原子, 可選擇性水解蛋白或多肽羧基端的精氨酸和賴氨酸。胰臟中羧肽酶A和羧肽酶B的最基本功能是在腸道內(nèi)分解肽段, 肽段由胰蛋白酶降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生, 羧肽酶A對于芳香族或脂肪類氨基酸殘基有最佳的切割能力, 羧肽酶B優(yōu)先切割堿性氨基酸, 但同時(shí)羧肽酶B也能切割一些非堿性的氨基酸殘基，在生物化學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。
圖1 羧肽酶B的性狀圖
結(jié)構(gòu)特性
羧肽酶B(CPB)在胰腺中以無活性的酶原形式合成, 羧肽酶原B的分子質(zhì)量為46ku, 由401個(gè)氨基酸組成;CPB分子質(zhì)量為35ku, 由306個(gè)氨基酸組成。胰腺羧肽酶原B有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:催化結(jié)構(gòu)域和激活部分。激活部分保護(hù)著活性部位。位于活性中心的Arg-145和激活部分的Asp-41之間形成鹽橋, 以防底物的C端羧基基團(tuán)結(jié)合到Arg-145上。酶原的Asp-41突變?yōu)锳sn或Ala, 可使酶原具有低的內(nèi)在酶活性, 說明少量底物結(jié)合到底物結(jié)合部位, 因此, Asp-41和Asp-145之間的鹽鍵形成有助于保持酶原的無活性狀態(tài)。羧肽酶B在科研中的應(yīng)用主要基于其切割特性，它可以用于蛋白質(zhì)和肽的測序, 在醫(yī)學(xué)上用于診斷胰腺炎。在重組胰島素的生產(chǎn)中,活性胰島素的產(chǎn)生也要依賴于羧肽酶B的切割。[1]
分離方法
Folk等早在1960年已從豬和牛的胰腺分離和鑒定了羧肽酶B。至今,已得到分離純化和鑒定的羧肽酶B有來源于人胰腺、駱駝、鴕鳥、非洲肺魚、鯉魚、、鯰魚、白蝦、小龍蝦、海星等。
活性測定
該方法基于羧肽酶B可以水解馬脲酰-L-精氨酸生成馬尿酸,而馬尿酸 (hippuric acid) 和馬脲酰-L-精氨酸 (hippuryl-L-arginine) 具有不同的吸收光譜。通常的分析方法如下:試驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制的0.001mol/L馬脲酰L-精氨酸的鹽溶液, 總測定體系3ml, 254nm處調(diào)零。加入的羧肽酶B溶液的體積5~20μl, 立即調(diào)節(jié)靈敏旋鈕置光吸收為零, 然后根據(jù)所需的時(shí)間頻繁記錄增加的吸收值，0.001mol/L的馬尿酸緩沖鹽溶液作為常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)對照。整個(gè)分析在室溫進(jìn)行 (25℃) 。最高達(dá)40%的水解反應(yīng)符合零級反應(yīng)動(dòng)力學(xué), 因此, 酶的濃度調(diào)整到10min內(nèi)水解反應(yīng)不超過30%。100%水解的光吸收值為0.36, 在測定范圍內(nèi), 數(shù)據(jù)顯示底物的水解速率與酶濃度呈明顯的正比關(guān)系。蛋白濃度和含量可通過測定獲得, 活力單位定義為在0.001mol/L的底物濃度下每分鐘的底物水解百分?jǐn)?shù)。[1]
金屬離子對羧肽酶B活性的影響
Mn2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+都能夠不同程度的提高酶的活力, 幾乎所有來源的羧肽酶B在和Co2+孵育一段時(shí)間之后, 活力都大大提高。Cu2+可以部分抑制重組羧肽酶B的活力, 而在Hg2+的存在下, 重組羧肽酶B的活力幾乎全部喪失。一些無機(jī)鹽在pH=8.0時(shí)對羧肽酶B顯示抑制作用,抑制作用順序?yàn)镹aI, KSCN, NaBr, MgSO4, NaCl, KCl, 和NaNO3, 其中, NaCl, KCl和Na2SO4在pH=7.2和pH=8.0時(shí)的抑制作用相同，0.9mol/L NaCl (1×10-4mol/L 馬尿酰-L-精氨酸) 可降低降解速率50%。[1]
穩(wěn)定性
對于不同來源的羧肽酶B活性研究表明，羧肽酶B的活力在pH8左右時(shí)為最大值,偏酸性和偏堿性的條件都會使酶活造成不同程度的損失。當(dāng)pH≥12時(shí),羧肽酶B的活力完全喪失。重組羧肽酶B在pH5時(shí), 活力接近零, 表明重組CPB的等電點(diǎn)就在pH=5左右。在一定的溫度范圍 (<60℃) 內(nèi), 羧肽酶B的活力隨著溫度的升高而上升, 隨后下降。溫度對活力的增效作用在所有來源的CPB中是一個(gè)普遍現(xiàn)象。比較來源于豬、海星等的CPB來說, 重組CPB的熱穩(wěn)定性要差一些。[1]
參考文獻(xiàn)
[1] 李素霞,張曉彥,張映新,等.羧肽酶B研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù), 2006, 13(4):4.