背景技術(shù)
過氧化氫酶（Hydrogen Peroxidase）又稱觸酶（Catalase，簡稱 CAT），是一類催化底物氧化還原反應(yīng)的酶，其主要功能是催化過氧化氫分解成氧氣和水。
過氧化氫酶的研究可追溯到19世紀(jì)初，迄今它已成為農(nóng)業(yè)，以及與之相關(guān)的食品與乳制品業(yè)、紙漿和造紙業(yè)、以及農(nóng)業(yè)環(huán)保產(chǎn)業(yè)中有應(yīng)用價值的酶之一。過氧化氫酶存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)的過氧化體中，它的主要作用是催化過氧化氫分解為水和氧氣，使得過氧化氫不至于與氧分子在鐵螯合作用下反應(yīng)生成非常厲害的-OH，過氧化氫酶的作用是使過氧化氫還原成水和氧分子。
過氧化氫酶可促進(jìn)漂白的進(jìn)行，可顯著提高羊毛的白度和親水性。這是由于過氧化氫酶促進(jìn)羊毛纖維初始受到快速的浸蝕，致使羊毛漂白較易進(jìn)行。因此，工業(yè)中可先利用過氧化氫酶對羊毛進(jìn)行預(yù)處理，是纖維表面裸露，再進(jìn)行漂白，效果會更好，且纖維損傷也易控制。
過氧化氫酶廣泛分布于動物、植物組織中和絕大多數(shù)的好氧菌和少數(shù)的厭氧微生物中。動物肝臟、紅細(xì)胞、植物葉綠體以及放線菌、細(xì)菌、真菌也含有過氧化氫酶，其中哺乳動物組織中 CAT 含量差異較大，肝臟和結(jié)締組織含量分別為最高和最低，過氧化氫酶在上述細(xì)胞組織中主要是與細(xì)胞器如線粒體和過氧化物體結(jié)合的形式存在，紅細(xì)胞中則以可溶的狀態(tài)存在。不同來源的過氧化氫酶的性質(zhì)差距較大，從動植物和人體內(nèi)獲得的過氧化氫酶的熱穩(wěn)定性較差；而微生物來源的過氧化氫酶的穩(wěn)定性相對表現(xiàn)較好，此外，微生物還具有易培養(yǎng)、來源廣、生產(chǎn)周期短且成本低等優(yōu)點(diǎn)。因此，微生物過氧化氫酶必將成為過氧化氫酶工業(yè)化發(fā)展的重要方向，利用基因工程技術(shù)手段開發(fā)出新型活性高的過氧化氫酶菌株具有重要的應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型過氧化氫酶及其應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建含有過氧化氫酶基因的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化入黑曲霉（Aspergillus niger）中，構(gòu)建得到黑曲霉工程菌株。該菌株能高效分泌表達(dá)過氧化氫酶，所產(chǎn)過氧化氫酶可廣泛運(yùn)用于食品、紡織、醫(yī)藥、造紙等領(lǐng)域中去除生產(chǎn)過程中的過氧化氫。
本發(fā)明一方面提供了一種過氧化氫酶，所述過氧化氫酶為：
（a）氨基酸序列為SEQ ID NO:1的酶；
（b）在（a）中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有過氧化氫酶活性的酶。
本發(fā)明，另一方面提供了編碼所述過氧化氫酶的基因，其一種編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
本發(fā)明還涉及一種表達(dá)載體，其攜帶有所述編碼過氧化氫酶的基因。
本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，其攜帶有所述表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及上述過氧化氫酶在降解過氧化氫中的應(yīng)用。
有益效果:
本發(fā)明提供了一種新型過氧化氫酶，并構(gòu)建了高效重組表達(dá)該酶的黑曲霉工程菌株，搖瓶發(fā)酵酶活高達(dá)3150U/mL。所述過氧化氫酶的最適作用pH值為8.5，最適作用溫度為50℃，其在4-50℃水浴中靜置1個小時，酶活比較穩(wěn)定，幾乎沒有變化，在50-60℃水浴中靜置1小時后仍能保留超過83%的酶活，70℃水浴中靜置1小時后仍然能保留超過50%的活力，耐熱效果顯著。本發(fā)明提供的新型過氧化氫酶能有效催化過氧化氫分解生成水和氧氣，10min時即將過氧化氫全部分解；而對照組所述市售過氧化氫酶，在20min時才將過氧化氫全部分解，取得了意料不到的技術(shù)效果，可廣泛運(yùn)用于食品、紡織、醫(yī)藥、造紙等領(lǐng)域中去除生產(chǎn)過程中的過氧化氫。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖儭?/p>
除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Haleet al., 2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
基因克?。?/p>
申請人首先提取曲霉（Aspergillus sp.）WLP（該菌株由發(fā)明人王藝璇于2017年1月篩選自山東省青島市嶗山區(qū)林場的落葉表面）的基因組總DNA。然后以基因組總DNA為模板，利用上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增條件為95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30個循環(huán)；72℃7min。
凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測序分析。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。經(jīng)NCBI Blast比對發(fā)現(xiàn)，該序列與煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的過氧化氫酶序列的相似性僅為47%，為一新的等位基因。