背景^[1-3]

C2C12小鼠成肌細(xì)胞是一種廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的連續(xù)鼠肌成纖維母細(xì)胞系。它由D.Yaffe和O.Saxel于1977年開發(fā)，最初來自粉碎損傷2小時后的2個月大的正常C3H小鼠股骨肌。這些細(xì)胞可以在高血清條件下迅速增殖，并在饑餓狀態(tài)（低血清條件）下分化成肌肉束。肌肉束是收縮型骨骼肌細(xì)胞的前身，具有類似肌母細(xì)胞的形態(tài)。C2C12細(xì)胞系的分化很快，容易形成可伸縮的肌管并生成特征性的肌蛋白。

在實(shí)驗研究中，C2C12小鼠成肌細(xì)胞經(jīng)常被誘導(dǎo)分化為多核肌管，這一過程是通過一種高度協(xié)調(diào)的序列程序來產(chǎn)生成熟的骨骼肌的過程。這種細(xì)胞系不僅是研究肌肉理想的細(xì)胞模型，也被廣泛應(yīng)用于其他領(lǐng)域如組織工程、再生醫(yī)學(xué)等。

在實(shí)驗中，為保證C2C12細(xì)胞的良好生長和分化，需要注意貼壁細(xì)胞生長到密度達(dá)70%時進(jìn)行傳代；不要讓細(xì)胞長得太滿甚至開始融合，這會影響后續(xù)成肌分化率；細(xì)胞消化完全后再吹打混勻，不要用槍頭把沒有消化好的細(xì)胞吹下來，以免細(xì)胞成團(tuán)。

C2C12小鼠成肌細(xì)胞

C2C12小鼠成肌細(xì)胞(C2C12 mouse myoblasts)是一種常用的實(shí)驗細(xì)胞系，來源于小鼠胚胎中的成肌細(xì)胞。這些細(xì)胞具有以下幾個主要特點(diǎn)：

多能性：C2C12小鼠成肌細(xì)胞具有多能性，可以分化為骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。

快速增殖：C2C12小鼠成肌細(xì)胞具有快速增殖的能力，可以在體外培養(yǎng)條件下快速擴(kuò)增。

容易轉(zhuǎn)染：由于其多能性和快速增殖的特點(diǎn)，C2C12小鼠成肌細(xì)胞易于進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)研究。

廣泛應(yīng)用于肌肉發(fā)育和疾病研究：由于其多能性和分化能力，C2C12小鼠成肌細(xì)胞廣泛應(yīng)用于肌肉發(fā)育和疾病研究，如肌肉萎縮癥、心肌梗死等。

可用于藥物篩選和毒性評價：由于其易于轉(zhuǎn)染和快速增殖的特點(diǎn)，C2C12小鼠成肌細(xì)胞也可用于藥物篩選和毒性評價。

C2C12小鼠成肌細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇C2C12小鼠成肌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)C2C12小鼠成肌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)C2C12小鼠成肌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

C2C12小鼠成肌細(xì)胞可以用于從PI3K/AKT信號通路探討龜鹿二仙膠含藥血清對C2C12成肌細(xì)胞增殖及分化的機(jī)制

探討龜鹿二仙膠含藥血清通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響下游指標(biāo)caspase9干預(yù)C2C12成肌細(xì)胞增殖及分化的機(jī)制并探討與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

方法(1)配制龜鹿二仙膠以制備含藥血清。選用8月齡SPF級SD大鼠60只制備龜鹿二仙膠含藥血清,雌雄各半,體質(zhì)量360-400 g并分別進(jìn)行同樣劑量的龜鹿二線膠及生理鹽水的灌胃,后進(jìn)行腹主動脈采血經(jīng)離心、滅活操作后得到含藥血清及空白血清。

(2) 實(shí)驗室培養(yǎng)C2C12小鼠成肌細(xì)胞并探索其生長曲線,在其對數(shù)生長期用不同濃度的含藥血清進(jìn)行干預(yù),同時觀測其增殖。

(3) 設(shè)置對照組,空白血清組及含藥血清組干預(yù)后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；

(4) 誘導(dǎo)C2C12小鼠成肌細(xì)胞分化,待其分化后檢測目標(biāo)myod、myog及caspase9的m RNA表達(dá)和myod、myog、p-akt、caspase9蛋白的表達(dá)情況。

結(jié)果：(1)10%龜鹿二仙膠含藥血清相比空白血清及普通組促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖,各組間數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；

(2) 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示10%含藥血清對比普通組有效抑制細(xì)胞凋亡,但是和10%空白血清組相比,沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

(3) RT-PCR結(jié)果顯示,與普通組相比較,空白血清組myod m RNA表達(dá)降低(P<0.01)、myog及caspase9m RNA表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05),龜鹿二仙膠含藥血清組myod、myog及caspase9m RNA明顯升高(P<0.01或P<0.05)。與空白血清組比,龜鹿二仙膠含藥血清組myod及myog m RNA表達(dá)較高(P<0.01)、caspase9 m RNA表達(dá)較低(P<0.01)。

(4) WB結(jié)果顯示,與普通組相比較,空白血清組及龜鹿二仙膠含藥血清組myod、myog、p-akt蛋白表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05)、caspase9蛋白表達(dá)降低(P<0.01或P<0.05)。與空白血清組比,龜鹿二仙膠含藥血清組myod、myog、p-akt蛋白表達(dá)較高(P<0.01或P<0.05)、caspase9蛋白表達(dá)較低(P<0.05)。

結(jié)論1.龜鹿二仙膠含藥血清對C2C12小鼠成肌細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖及分化作用;

2.龜鹿二仙膠含藥血清可能通過激活C2C12小鼠成肌細(xì)胞的PI3K/AKT通路,活化AKT的表達(dá),進(jìn)而抑制凋亡相關(guān)基因caspase 9的表達(dá),減少成肌細(xì)胞凋亡,從而產(chǎn)生影響。

參考文獻(xiàn)

[1]The ERG1A Potassium Channel Induces Expression of Genes Related to Skeletal Muscle Atrophy in C2C12 Myotubes.Pond Amber;Whitimore Clayton;Thimmapuram Jyothi;Hockerman Gregory.The FASEB Journal,2021

[2]Sarcopenia and osteoporosis are interrelated in geriatric inpatients..Reiss J;;Iglseder B;;Alzner R;;Mayr-Pirker B;;Pirich C;;K?ssmann H;;Kreutzer M;;Dovjak P;;Reiter R.Zeitschrift fur Gerontologie und Geriatrie,2019

[3]Evaluation of 18-Week Whole-Body Vibration Training in Normobaric Hypoxia on Lower Extremity Muscle Strength in an Elderly Population..Camacho-Cardenosa Marta;;Camacho-Cardenosa Alba;;Brazo-Sayavera Javier;;Olcina Guillermo;;Tomas-Carus Pablo;;Timón Rafael.High altitude medicine&biology,2019

[4]Age-related bone loss and sarcopenia in men.Micha?l R.Laurent;;Lenore Dedeyne;;Jolan Dupont;;Bea Mellaerts;;Marian Dejaeger;;Evelien Gielen.Maturitas,2019

[5]朱國濤.從PI3K/AKT信號通路探討龜鹿二仙膠含藥血清對C2C12成肌細(xì)胞增殖及分化的機(jī)制[D].福建中醫(yī)藥大學(xué),2021.