背景^[1-3]

人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人醛縮酶(ALD)單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中的人醛縮酶(ALD)與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人醛縮酶(ALD)抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物TMB,出現(xiàn)藍(lán)色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測OD值，人醛縮酶(ALD)濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中人醛縮酶(ALD)濃度。

人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒

人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒標(biāo)本收集與試劑準(zhǔn)備:

1.血清、血漿樣本收集應(yīng)使用一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝均可），血清、血漿避免使用溶血，高血脂標(biāo)本，標(biāo)本懸浮物應(yīng)離心去除，使標(biāo)本清澈透明。待測樣本應(yīng)盡早檢測，2-8℃保存48小時(shí)；更長時(shí)間須冷凍（-20℃或-80℃）保存，避免反復(fù)凍融。

2.洗滌液配置：用蒸餾水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的蒸餾水）

3.標(biāo)準(zhǔn)品配制：取7個(gè)1.5ml離心管，分別標(biāo)注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64，blank。從第壹至七管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液200ul。在第壹管中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液200ul，置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第六管中吸出200ul棄去，第七管為空白對照。

4.生物素化抗體工作液配置:使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×工作液，根據(jù)所需用量配置，當(dāng)日使用，剩余棄之。

5.TMB顯色液的配置：使用前10分鐘，將TMB顯色液A液和B液1：1混合，避光放置備用。

6. 如果檢測的樣本中靶蛋白濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最糕值，建議重新檢測，請根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。

人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為72 pg/mL，48 pg/mL，24pg/mL，12 pg/mL，6 pg/mL）。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

應(yīng)用^[4][5]

人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒可以用于乙型肝炎病毒主S蛋白相互作用蛋白—醛縮酶B驗(yàn)證及功能研究

證實(shí)醛縮酶B作為乙型肝炎病毒主S蛋白結(jié)合蛋白一種候選蛋白,探討醛縮酶B生物學(xué)功能。

方法:(1)以人HEPG2細(xì)胞RNA為模板,用RT-PCR方法擴(kuò)增出ALDOB基因。將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)真核載體PCMV5內(nèi),構(gòu)建含ALDOB基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。以實(shí)驗(yàn)室重組全S質(zhì)粒為模板,利用PCR擴(kuò)增主S蛋白基因,構(gòu)建PCMV4-Flag-主S基因表達(dá)質(zhì)粒,分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,用人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒免疫熒光和Western blot等方法檢測ALDOB及主S在293FT細(xì)胞中的表達(dá)。(2)將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞,激光共聚焦試驗(yàn)明確主S蛋白和醛縮酶B空間定位。將主S基因表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞,構(gòu)建主S穩(wěn)轉(zhuǎn)株,通過免疫共沉淀方法,驗(yàn)證主S蛋白與醛縮酶B相互結(jié)合。(3)構(gòu)建靶向醛縮酶B重組干擾質(zhì)粒siALDOB-Pu6,導(dǎo)入HEPG2細(xì)胞中,篩選出干擾質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),探討ALDOB在肝癌細(xì)胞HepG2生長、侵襲、凋亡等方面的作用。

人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒結(jié)果:(1)核酸序列分析的結(jié)果表明,克隆的ALDOB基因與主S基因在GenBank中分別與已登記基因序列100%同源。人醛縮酶(ALD)Elisa試劑盒免疫熒光結(jié)果顯示:ALDOB蛋白在細(xì)胞質(zhì)表達(dá);主S蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。Western blot結(jié)果顯示:在約40KD位置有目的條帶,與預(yù)期的重組ALDOB蛋白大小一致;在約26KD位置有預(yù)期的主S蛋白表達(dá)。(2)通過免疫共沉淀方法,成功確認(rèn)醛縮酶B是乙型肝炎病毒主S蛋白結(jié)合蛋白一種候選蛋白。(3)特異性抑制ALDOB表達(dá)的HepG2細(xì)胞株較沒有抑制ALDOB的HepG2細(xì)胞株,細(xì)胞增殖加快、侵襲能力增強(qiáng)、凋亡率增加。穩(wěn)定干擾ALDOB的HepG2細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株較穩(wěn)轉(zhuǎn)空載Pu6的HepG2細(xì)胞株生長結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了含ALDOB基因以及主S基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。(2)醛縮酶B是乙型肝炎病毒主S蛋白的結(jié)合蛋白。(3)ALDOB能夠抑制HepG2細(xì)胞增殖,使HepG2細(xì)胞侵襲能力下降,抑制HepG2細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)

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