01  采用 His 標(biāo)簽進(jìn)行蛋白純化時，為何雜質(zhì)含量偏高？

可能原因 1：蛋白酶部分降解目的蛋白

• 原因闡述：在蛋白純化過程中，蛋白酶可能處于活躍狀態(tài)，從而對目的蛋白發(fā)起攻擊并造成部分降解，致使最終獲得的蛋白產(chǎn)物中混有較多雜質(zhì)。
• 解決對策：向反應(yīng)體系中添加多種蛋白酶抑制劑，憑借抑制劑對蛋白酶活性的抑制作用，減少目的蛋白被降解的可能性，進(jìn)而提升蛋白純化的效果。

可能原因 2：雜質(zhì)蛋白與鎳柱親和力較強(qiáng)

• 原因剖析：部分雜質(zhì)蛋白可能具備與鎳柱較強(qiáng)的結(jié)合能力，在純化流程中與目的蛋白一同吸附于鎳柱上，難以在常規(guī)條件下分離，最終導(dǎo)致純化后的蛋白雜質(zhì)較多。
• 解決途徑：適當(dāng)提高雜質(zhì)蛋白與鎳柱結(jié)合起始階段的咪唑濃度，利用咪唑與鎳柱的競爭結(jié)合作用，在保證目的蛋白仍能有效結(jié)合的前提下，促使雜質(zhì)蛋白優(yōu)先從鎳柱上洗脫下來，從而提高蛋白純度。

可能原因 3：雜蛋白和目的蛋白結(jié)合

• 原因解析：在某些情況下，雜蛋白可能會與目的蛋白發(fā)生相互作用并結(jié)合在一起，這種結(jié)合態(tài)的雜蛋白在常規(guī)純化步驟中難以與目的蛋白分離，使得純化后的蛋白含有較多雜質(zhì)。
• 解決手段：在超聲處理之前向體系內(nèi)添加去垢劑（如 1%-2% Tritonx - 100）或者還原劑，通過破壞雜蛋白與目的蛋白之間的相互作用，使二者分離，以便在后續(xù)純化過程中將雜質(zhì)蛋白去除。

可能原因 4：洗滌不充分

• 原因說明：若在蛋白純化過程中對鎳柱的洗滌操作不夠徹底，未能將吸附在鎳柱上的雜質(zhì)蛋白充分洗去，這些雜質(zhì)就會隨著目的蛋白的洗脫一同被收集，導(dǎo)致最終蛋白產(chǎn)品雜質(zhì)較多。
• 解決措施：增加洗滌的次數(shù)，優(yōu)化洗滌流程，確保鎳柱得到充分洗滌，最大程度地去除雜質(zhì)蛋白，提高目的蛋白的純度。

02  為何融合蛋白無法與金屬螯合親和層析柱結(jié)合？

可能原因 1：超聲功率失當(dāng)致使蛋白處理異常

• 原因剖析：超聲功率若過大，會使蛋白發(fā)生炭化現(xiàn)象，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)與活性受損，無法正常與金屬螯合親和層析柱相互作用；而超聲功率過小，則無法充分破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得蛋白難以釋放出來，進(jìn)而不能與層析柱結(jié)合。
• 解決舉措：對超聲功率進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，或者在超聲操作之前添加溶菌酶，借助溶菌酶對細(xì)胞壁的裂解作用，提升細(xì)胞破碎效率，確保蛋白能夠有效釋放并具備與層析柱結(jié)合的條件。

可能原因 2：組氨酸標(biāo)簽未能充分暴露

• 原因解析：在某些情況下，組氨酸標(biāo)簽可能由于空間位阻或其他因素，在天然狀態(tài)下暴露不完全，使得其難以與金屬螯合親和層析柱上的金屬離子形成有效結(jié)合。
• 解決方法：將純化環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃詶l件，如采用 4 - 8 M 脲或 4 - 6 M 鹽酸胍處理樣品。不過需要注意的是，常規(guī) Ni - 6FF (IDA) 在變性條件下鎳離子容易脫落，此時可選用能夠耐受變性劑的螯合填料，例如月旭材料的親和填料 Ni Tanrose FF (NTA)，以保障在組氨酸標(biāo)簽充分暴露的情況下實現(xiàn)有效純化。

可能原因 3：His 標(biāo)簽出現(xiàn)丟失情況

• 原因探究：其一，可能是在蛋白表達(dá)過程中 His 標(biāo)簽未能正常表達(dá)，這可能與上游構(gòu)建環(huán)節(jié)有關(guān)；其二，蛋白與層析柱的孵育時間不足，導(dǎo)致結(jié)合不充分；其三，所螯合的金屬離子并非最適宜與 His 標(biāo)簽結(jié)合的類型；其四，所使用的螯合填料載量與特異性不能滿足要求。
• 解決策略：首先，通過 WB 檢測確認(rèn) His 是否表達(dá)，若未表達(dá)則重新審視上游構(gòu)建過程，嘗試改變 His - tag 的位置（C - 端或 N - 態(tài)），必要時增加 His 個數(shù)。其次，延長孵育時間并降低流速，給予蛋白與層析柱充分的結(jié)合時間。再者，篩選不同的金屬離子進(jìn)行螯合，確定最有利于與 His 標(biāo)簽結(jié)合的金屬離子種類。最后，選用高載量高特異性的螯合填料，如月旭材料的親和填料 Ni Tanrose FF（IDA)，提高蛋白與層析柱的結(jié)合效率與特異性，從而解決 His 標(biāo)簽丟失導(dǎo)致的不掛柱問題。

03  Ni 柱在經(jīng)過數(shù)次使用后，載量出現(xiàn)下降情況，掛柱效率也變低，要如何應(yīng)對這種狀況呢？

可能原因：沉淀累積及蛋白異常結(jié)合致使有效位點被占

在 Ni 柱多次使用過程中，沉淀物質(zhì)逐漸堆積，變性蛋白以及非特異性結(jié)合的蛋白會附著在柱體上，它們占據(jù)了原本可與目標(biāo)蛋白有效結(jié)合的位點，并且這些雜質(zhì)無法單純依靠常規(guī)洗脫液完全清除，從而導(dǎo)致柱載量降低，掛柱效率變差。

解決方法：

一、溫和清洗流程

此方法旨在以相對溫和的試劑處理 Ni 柱，在不損傷柱體結(jié)構(gòu)與性能的前提下，盡可能去除影響柱效的雜質(zhì)。

• 針對沉淀或變性物質(zhì)：使用濃度為 6M 的鹽酸胍或 8M 的尿素溶液，以 2 倍柱體積的量對 Ni 柱進(jìn)行洗滌。這兩種試劑能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使沉淀或變性的蛋白質(zhì)從柱體上解離下來。隨后，再用 5 倍柱體積的緩沖液進(jìn)行沖洗，以去除殘留的鹽酸胍或尿素以及被解離下來的雜質(zhì)，恢復(fù)柱體的緩沖環(huán)境。

• 針對疏水結(jié)合物質(zhì)：采用 2 倍柱體積的 1% Triton X - 100 溶液進(jìn)行洗滌。Triton X - 100 是一種非離子型表面活性劑，具有良好的去污和脫脂能力，能夠有效去除與柱體發(fā)生疏水結(jié)合的物質(zhì)。洗滌后同樣用 5 倍柱體積的緩沖液沖洗，確保柱體干凈且緩沖體系穩(wěn)定。若經(jīng)過上述溫和清洗后，Ni 柱的性能改善不明顯，則需考慮采用強(qiáng)烈清洗方式。

二、強(qiáng)烈清洗流程

強(qiáng)烈清洗方式較為復(fù)雜，涉及多個步驟與不同試劑的使用，但能更深入地清潔 Ni 柱，恢復(fù)其載量與掛柱效率。

• 脫鎳操作：首先使用 5 - 10 倍柱體積的脫鎳緩沖液（20 mM 磷酸鈉，0.5 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4）對 Ni 柱進(jìn)行洗滌。EDTA 能夠與鎳離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而將鎳離子從柱體上洗脫下來，使柱體處于無鎳狀態(tài)，為后續(xù)的深度清潔創(chuàng)造條件。完成脫鎳后，用 5 - 10 倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，去除殘留的脫鎳緩沖液，接著再用 5 - 10 倍柱體積的雙蒸水沖洗，進(jìn)一步凈化柱體。

• 去除離子型雜蛋白：用 5 倍柱體積的 1.5 M NaCl 溶液對柱體進(jìn)行洗滌。高濃度的 NaCl 溶液能夠通過離子交換作用，去除與柱體結(jié)合的離子型雜蛋白。洗滌后用 10 倍柱體積的雙蒸水沖洗，以清除殘留的 NaCl 溶液。

• 去除沉淀或變性蛋白：采用 1M 氫氧化鈉溶液處理柱體，結(jié)合時間為 1 - 2 小時。氫氧化鈉是一種強(qiáng)堿，能夠使沉淀或變性的蛋白質(zhì)發(fā)生水解或變性，從而從柱體上脫離。處理后用 10 倍柱體積的平衡緩沖液和 10 倍柱體積的雙蒸水依次進(jìn)行沖洗，確保柱體的酸堿度恢復(fù)正常且無殘留雜質(zhì)。

• 去除疏水蛋白或者脂蛋白：使用 5 - 10 倍柱體積的 30% 異丙醇溶液對柱體進(jìn)行清洗。異丙醇具有較強(qiáng)的溶解能力，能夠有效去除疏水蛋白和脂蛋白。清洗后用 10 倍柱體積的雙蒸水洗滌，去除殘留的異丙醇。

• 生鎳操作：在完成上述一系列清潔步驟后，需要重新將鎳離子加載到柱體上，以恢復(fù)其親和純化能力。用 0.1M 硫酸鎳溶液上柱，使鎳離子與柱體結(jié)合。隨后用 5 倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液進(jìn)行洗滌，去除多余的硫酸鎳溶液，使柱體達(dá)到可使用的平衡狀態(tài)。若 Ni 柱在清洗后不需要立即使用，可將其保存在 20% 乙醇溶液中，防止微生物滋生和柱體干涸。

04  為何融合蛋白與螯合填料結(jié)合后難以被洗脫？

可能原因 1：洗脫條件力度不足致使融合蛋白滯留柱上

由于所采用的洗脫條件相對溫和，未能有效破壞融合蛋白與螯合填料之間較強(qiáng)的結(jié)合力，從而導(dǎo)致融合蛋白依然牢固地附著在柱體之上，無法順利被洗脫下來。

解決方法：優(yōu)化洗脫條件以增強(qiáng)洗脫效果

通過逐步增加咪唑的濃度構(gòu)建梯度洗脫體系，或者適當(dāng)降低洗脫液的 pH 值，利用這兩種方式來探索并確定能夠?qū)崿F(xiàn)融合蛋白最佳洗脫效果的條件組合，促使融合蛋白從螯合填料上有效解離。

可能原因 2：低 pH 洗脫引發(fā)鎳離子脫落問題

當(dāng)采用降低 pH 值的方法進(jìn)行洗脫操作時，如果 pH 值低于 3.5，會導(dǎo)致螯合填料上的鎳離子發(fā)生脫落現(xiàn)象。這不僅會破壞填料的親和性能，還會使洗脫過程失去對融合蛋白的特異性洗脫能力，進(jìn)而導(dǎo)致融合蛋白無法正常洗脫。

解決方法：調(diào)整洗脫策略避免鎳離子脫落

摒棄低 pH 值洗脫的方法，轉(zhuǎn)而采用咪唑競爭性洗脫方式。咪唑能夠與融合蛋白競爭結(jié)合填料上的鎳離子，在不影響鎳離子與填料結(jié)合穩(wěn)定性的前提下，實現(xiàn)融合蛋白的洗脫，確保洗脫過程的有效性和填料的可重復(fù)使用性。

可能原因 3：蛋白沉淀于柱體之上阻礙洗脫

在某些情況下，融合蛋白可能會在柱體上發(fā)生沉淀現(xiàn)象，這可能是由于上樣量過大、蛋白濃度過高或者環(huán)境因素等導(dǎo)致的。沉淀后的蛋白會緊密附著在柱體表面，嚴(yán)重阻礙洗脫過程的順利進(jìn)行。

解決方法：針對性處理柱上蛋白沉淀問題

• 從源頭上控制上樣量，減少進(jìn)入柱體的蛋白總量，或者在洗脫過程中采用咪唑的線性梯度洗脫方式替代分步洗脫，以此降低蛋白在柱體上的局部濃度，減少沉淀形成的可能性。同時，可以嘗試向洗脫緩沖液中添加去污劑（如試用不同濃度的去污劑）或者改變 NaCl 的濃度，通過改變洗脫環(huán)境的理化性質(zhì)來溶解沉淀的蛋白。另外，還可以考慮在變性條件（如使用 4 - 8 M 脲或 4 - 6 M 鹽酸胍）下進(jìn)行洗脫，使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而從柱體上脫離。
• 若蛋白在柱上已經(jīng)發(fā)生變性固化，則使用 0.5M 氫氧化鈉溶液對柱體進(jìn)行清洗。氫氧化鈉具有較強(qiáng)的堿性和去污能力，能夠破壞變性固化蛋白與柱體之間的相互作用，使蛋白從柱體上解離并被清洗掉，但在使用過程中需要注意其對柱體材料可能造成的損傷，使用后需對柱體進(jìn)行充分的中和與清洗處理，以恢復(fù)柱體的性能。

可能原因 4：非特異性相互作用干擾洗脫

融合蛋白與螯合填料之間可能存在非特異性的疏水相互作用或者其他類型的非特異性相互作用，這些額外的相互作用會增強(qiáng)蛋白與柱體的結(jié)合力，使得在常規(guī)洗脫條件下難以將融合蛋白洗脫下來。

解決方法：削弱非特異性相互作用促進(jìn)洗脫

向洗脫緩沖液中添加非離子去污劑（如 2% Triton X - 100），非離子去污劑能夠降低蛋白與柱體之間的疏水相互作用，破壞非特異性結(jié)合。或者適當(dāng)增加 NaCl 的濃度，利用鹽離子的屏蔽作用減少蛋白與柱體之間的靜電相互作用等非特異性相互作用，從而提高融合蛋白的洗脫效率。

可能原因 5：填料表面蛋白聚集影響洗脫

在填料表面可能會形成高密度的融合蛋白聚集現(xiàn)象，這可能是由于所選用的填料載量與實際樣品蛋白含量不匹配，載量過高導(dǎo)致蛋白在填料表面過度堆積而形成聚集。聚集后的蛋白群體與填料之間的相互作用復(fù)雜且緊密，不利于洗脫過程的進(jìn)行。

解決方法：合理選擇填料載量避免蛋白聚集

在進(jìn)行實驗之前，根據(jù)樣品中融合蛋白的含量和性質(zhì)，選擇合適載量的填料，避免盲目追求高載量。合適的填料載量能夠使蛋白在填料表面均勻分布，減少聚集現(xiàn)象的發(fā)生，從而有利于后續(xù)的洗脫操作，提高融合蛋白的回收效率。

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