西湖大學(xué)生命科學(xué)院 Kiryl Piatkevich 課題組聯(lián)合莫斯科國立大學(xué) Fedor Subach 課題組在 Nature Methods 期刊發(fā)表了題為：Bright and stable monomeric fluorescent protein derived from StayGold 的研究論文。
該研究采用定向進(jìn)化策略，成功開發(fā)出了StayGold的單體版本，命名為mBaoJin。該熒光單體不僅繼承了原蛋白的優(yōu)異特性，還具備了更廣泛的應(yīng)用潛力。通過對mBaoJin在不同pH條件下的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并將其與StayGold及其他主流熒光蛋白進(jìn)行比較，他們還揭示了單體化所必須的關(guān)鍵氨基酸突變，并進(jìn)一步闡明了其優(yōu)異光穩(wěn)定性的分子機制。
mBaoJin，亮度高和光穩(wěn)定性強，加之其出色的化學(xué)穩(wěn)定性，使其成為研究細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和動態(tài)變化過程中，特別是超分辨顯微成像技術(shù)和膨脹顯微技術(shù)的理想熒光蛋白工具。
為了單體化二聚體綠色熒光蛋白StayGold，作者構(gòu)建圖1a的蛋白表達(dá)載體，將SatyGold的突變文庫與AraC蛋白的DNA結(jié)合域（AraCDNA）進(jìn)行融合。當(dāng)突變體是單體時，與AraC融合的突變體蛋白驅(qū)動報告基因mTagBFP的表達(dá)水平比較低；當(dāng)突變體是二聚體時，與AraC融合的突變體蛋白驅(qū)動報告基因mTagBFP的表達(dá)水平比較高。在每輪隨機突變過程中，作者挑選藍(lán)色熒光比較暗而綠色熒光最亮的菌落，并用液相色譜確認(rèn)它們的寡聚態(tài)。經(jīng)過八輪定向進(jìn)化后，最終確定一個亮度最高的綠色熒光蛋白單體，同時使用mNeonGreen蛋白的N端和C端作為連接肽段，以確保其在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并將其名為mBaoJin。
與StayGold的氨基酸序列比對，mBaoJin具有以下突變：S55T、H77R、E80G、Q140P、H141Q、C165Y、N171Y和T201A。為了檢測mBaoJin在哺乳動物細(xì)胞中的是否為單體狀態(tài)，作者在HeLa細(xì)胞中表達(dá)了與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定結(jié)構(gòu)域（CytERM）融合的mBaoJin，統(tǒng)計沒有出現(xiàn)渦旋結(jié)構(gòu)的健康細(xì)胞的比例。同時使用了StayGold的串聯(lián)和單體化版本（td8oxStayGold、StayGold-E138D和mStayGold，也稱為QC2-6 FIQ）以及經(jīng)過驗證的單體（mEGFP、mClover3、mGreenLantern）和弱二聚體（EGFP、Venus）作為比較。mBaoJin的得分為93.7%，在細(xì)胞中達(dá)到了單體性的閾值。這些結(jié)果確定了mBaoJin是一種單體蛋白。
單體化StayGoldmBaoJin的晶體結(jié)構(gòu)
在文中，作者解析了mBaoJin在pH為 6.5、4.6和8.5時的X射線晶體結(jié)構(gòu)，并與StayGold二聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)mBaoJin在不同pH值下的結(jié)構(gòu)差異不大，mBaoJin的二聚界面在A和B亞基之間的接觸較少，mBaoJin的所有結(jié)構(gòu)中熒光團(tuán)附近的氯離子口袋相似且與StayGold相似。為了進(jìn)一步理解mBaoJin增強光穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，作者對與熒光基團(tuán)相互作用的位點134、137、152（按PDB中的編號）的氨基酸進(jìn)行了點突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mBaoJin/N137K、mBaoJin/S134P和mBaoJin/V152E突變體的光漂白速度比mBaoJin快1.5-6.5和4.5倍。比較耐光漂白的mBaoJin蛋白和較不耐光漂白的mNeonGreen及EGFP蛋白的熒光團(tuán)環(huán)境，發(fā)現(xiàn)耐光漂白的mBaoJin蛋白在熒光基團(tuán)周圍形成更多的氫鍵和疏水鍵。
在驗證mBaoJin為單體蛋白后，作者進(jìn)一步對純化的mBaoJin蛋白的光譜和生化屬性進(jìn)行了表征。實驗發(fā)現(xiàn)，與StayGold相比，mBaoJin所產(chǎn)生的單體化突變并未改變吸收和熒光光譜特性。然而，mBaoJin的分子亮度比StayGold低1.09倍，但比mNeonGreen亮1.24倍。在低激發(fā)強度（約13 mW/mm2，活細(xì)胞成像條件）下，mBaoJin的光穩(wěn)定性比EGFP、mNeonGreen和mGreenLantern分別高15倍、9倍和130倍，盡管在高功率（約120 mW/mm2）下這種差異不那么顯著。mBaoJin在37℃下快速成熟，成熟時間半值為7.5分鐘，比StayGold、mNeonGreen和EGFP分別快1.8倍、2.2倍和1.8倍，是最快成熟的熒光蛋白之一。此外，mBaoJin的熒光表現(xiàn)出極高的化學(xué)穩(wěn)定性，與其他單體GFPs相比，mBaoJin具有較高的pH穩(wěn)定性，pKa值為4.37。mBaoJin在6M GdnHCl中孵育24小時后，其熒光增加了18%，而化學(xué)穩(wěn)定性最強的熒光蛋白之一hfYFP的熒光僅增加了1%，StayGold的熒光減少了2%，mNeonGreen的熒光則完全猝滅。
在HEK和HeLa細(xì)胞中，通過P2A使 mBaoJin與紅色熒光蛋白（FusionRed或mCherry）共表達(dá)，紅色熒光則對蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。與EGFP相比，mBaoJin在HEK和HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)亮度一致地高出約70-140%，同時與(n1)StayGold(c4)和mStayGold相當(dāng)。此外，mBaoJin在經(jīng)過膨脹顯微前處理的HEK細(xì)胞中，其亮度分別比mNeonGreen、hfYFP和mStayGold高出17倍、1.4倍、3.8倍。在HEK細(xì)胞進(jìn)行的光漂白實驗中，作者使用了比平時活細(xì)胞成像高3.5倍的照明功率（即50.5 mW/mm2），以便在較短時間內(nèi)觀察到光漂白率的差異。除了StayGold及其衍生熒光蛋白比mBaoJin高1.9至2.3倍的光穩(wěn)定性，mBaoJin的光漂白速度比其他現(xiàn)有的GFPs慢了4.6至85倍。StayGold的串聯(lián)二聚體td8ox2StayGold，在亮度和光穩(wěn)定性方面超過了所有測試的GFPs，在HEK細(xì)胞中表現(xiàn)最出色。
mBaoJin與結(jié)構(gòu)蛋白融合后成像，包括vimentin, mitochondrial presequence of human cytochrome c oxidase subunit VIII, H2B, keratin, α-tubulin, β-actin等。作者使用超分辨率共聚焦顯微鏡對mBaoJin和mNeoGreen與α-tubulin的融合蛋白進(jìn)行長達(dá)60分鐘的成像，mBaoJin沒有發(fā)生光漂白，而在相同條件下，mNeonGreen比初始熒光值降低了25%。接著使用稀疏去卷積結(jié)構(gòu)照明顯微鏡對活細(xì)胞中的肌動蛋白纖維進(jìn)行成像，在更高的照明功率（150-200 mW/mm2）下，mBaoJin的光穩(wěn)定性比mNeonGreen高出2.5-4倍。
在線蟲中，mBaoJin在神經(jīng)元中的細(xì)胞內(nèi)亮度比mNeonGreen高出約2倍，在連續(xù)的寬場照明下，mBaoJin展現(xiàn)了比mNeonGreen慢4倍的光漂白速率，在15分鐘的光漂白后保留了超過50%的初始熒光。
在活的小鼠腦組織中，mBaoJin比mNeonGreen亮1.7倍，但比mStayGold暗1.7倍。然而，在PFA固定的腦組織中，mStayGold和mBaoJin表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)牧炼群凸夥€(wěn)定性，顯著優(yōu)于mNeonGreen。由于mBaoJin的高化學(xué)穩(wěn)定性，將其應(yīng)用在HeLa細(xì)胞的線粒體、微絲微管以及小鼠腦組織的膨脹顯微成像中。重要的是，mBaoJin在膨脹的腦組織中也保持了其高光穩(wěn)定性，使得能夠進(jìn)行大體積的超分辨率成像，同時減少光漂白。
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