北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳知行研究員課題組與德國(guó)科隆大學(xué)合作，在Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.雜志上發(fā)表了題為“An Aldehyde-crosslinking Mitochondrial Probe for STED Imaging in Fixed Cells” 的研究論文。該研究報(bào)道了一款適用于STED顯微鏡的線粒體內(nèi)嵴染料PK Mito Orange Fix（PKMO FX），其不僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞線粒體的STED成像，在細(xì)胞經(jīng)過(guò)甲醛或戊二醛等常用醛類固定液固定后，依然能高效保留線粒體熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)固定細(xì)胞的線粒體STED成像（圖1）以及光電聯(lián)用線粒體超分辨成像（STED-CLEM）。
論文截圖
陳知行課題組在過(guò)去幾年的時(shí)間里研發(fā)了PKMito系列線粒體內(nèi)嵴超分辨探針（PNAS 2022 cover story, ChemSci 2020），在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。德國(guó)科隆大學(xué)細(xì)胞成像平臺(tái)Christian Jüngst博士自2022年起就利用PKMito Orange探針支持多個(gè)線粒體、衰老等方向的前沿課題（Nat. Commun. 2022, 6704）。Jüngst博士與陳知行課題組經(jīng)常進(jìn)行討論，提出了一個(gè)設(shè)想：活細(xì)胞線粒體染料經(jīng)過(guò)固定之后往往喪失大部分線粒體定位，能否設(shè)計(jì)一款能夠在固定后仍可以進(jìn)行STED內(nèi)嵴成像？這樣可以兼容其他的固定細(xì)胞熒光標(biāo)記策略，還可以方便保存更多細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的樣品，利于超分辨顯微成像的進(jìn)一步普及。
圖1：PK Mito Orange Fix標(biāo)記的HeLa細(xì)胞經(jīng)戊二醛固定后的線粒體多層STED成像。比例尺：5μm
線粒體探針大多依賴于線粒體膜電位(MMP)來(lái)驅(qū)動(dòng)帶一個(gè)帶正電的分子特異性定位線粒體。雖然這些探針在活細(xì)胞成像時(shí)表現(xiàn)良好，但當(dāng)細(xì)胞固定時(shí)，線粒體MMP快速改變，非共價(jià)的線粒體探針會(huì)迅速擴(kuò)散出線粒體，隨之沾染在附近的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，導(dǎo)致固定細(xì)胞線粒體成像一直存在亮度低、信噪比差等問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，發(fā)展可固定的線粒體探針的思路是在探針上偶聯(lián)一個(gè)可以與蛋白質(zhì)的親核殘基反應(yīng)的活性基團(tuán)，例如目前最常用的可固定線粒體染料MitoTracker系列采用芐氯與蛋白的Cys反應(yīng)，形成共價(jià)連接。然而，受限于蛋白與染料低的共價(jià)交聯(lián)效率，這些染料在固定后的成像效果并不盡人意。且隨著超分辨顯微成像的發(fā)展，誕生于20世紀(jì)的MitoTracker系列染料的光學(xué)性質(zhì)已經(jīng)不能滿足STED成像的需求，在活細(xì)胞STED成像上表現(xiàn)不佳，更難用于固定細(xì)胞STED成像。
該研究在課題組之前關(guān)于PK Mito Orange研究的基礎(chǔ)上，沿用Cy3.5這一適用于線粒體STED成像的染料母核，進(jìn)一步發(fā)展可固定的線粒體探針。作者在Cy3.5上偶聯(lián)一些常用的共價(jià)反應(yīng)基團(tuán)，如芐氯、NHS酯等，得到的可共價(jià)探針在細(xì)胞固定后效果欠佳。作者轉(zhuǎn)變思路，將伯胺偶聯(lián)在Cy3.5上，雖然末端為氨基的Cy3.5在活細(xì)胞染色時(shí)不能與蛋白共價(jià)交聯(lián)，但在加入醛類固定液后可基于胺與醛的快速縮合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白-染料-固定液之間的高效交聯(lián)。作者將該探針命名為PKMO FX，這種策略也被稱為“固定驅(qū)動(dòng)的化學(xué)交聯(lián)”（圖2）。
圖2：PKMO FX探針與傳統(tǒng)可固定線粒體探針采用不同的交聯(lián)策略
作者比較了各種可固定染料在固定前后線粒體的熒光保留率和圖像信噪比，PKMO FX表現(xiàn)最優(yōu)，此兩項(xiàng)性能均有大幅提升。作者展示了細(xì)胞經(jīng)PKMO FX染色、醛類固定液固定后的線粒體STED成像圖，圖像可見清晰的線粒體內(nèi)嵴，分辨率低至約70nm。多層層掃STED成像展示了線粒體在Z方向上形態(tài)的多樣性。PKMO FX也適用于包括癌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元，以及蛋白缺陷型細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞系的超分辨成像。
進(jìn)一步地，作者將PKMO FX與其他多種兼容固定的標(biāo)記方法聯(lián)用，包括表達(dá)熒光蛋白、自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽、共染其他可固定染料、代謝標(biāo)記以及免疫熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的固定后多色成像（圖3）。
圖3：PKMO FX探針標(biāo)記的線粒體內(nèi)嵴與免疫標(biāo)記的Actin。比例尺：1μm
作者將PKMO FX用于光電鏡聯(lián)用（CLEM），在電鏡成像圖上“點(diǎn)亮”線粒體超微結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步地，他用SYBR Gold 染色的mtDNA與PKMO FX染色的線粒體內(nèi)嵴實(shí)現(xiàn)了雙色CLEM，以高的定位精度在電鏡圖上標(biāo)記mtDNA。實(shí)驗(yàn)表明，mtDNA主要分布在線粒體嵴內(nèi)大的空腔處，這是單獨(dú)使用EM難以觀測(cè)到的。線粒體信號(hào)架起了其他熒光通道與電鏡圖像的橋梁，有望成為CLEM領(lǐng)域的新工具。
圖4：PKMO FX探針實(shí)現(xiàn)線粒體內(nèi)嵴與mtDNA的雙色光電聯(lián)用成像。比例尺：3μm
綜上，作者采用了一種新的生物偶聯(lián)策略，開發(fā)出了一種兼容固定細(xì)胞STED成像的新型線粒體探針。PKMO FX既具有優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，又能在固定后保持強(qiáng)線粒體熒光，首次實(shí)現(xiàn)了僅通過(guò)小分子染料實(shí)現(xiàn)對(duì)固定細(xì)胞線粒體內(nèi)嵴超微結(jié)構(gòu)的可視化。
北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院2020級(jí)博士生陳婧婷為本文第一作者。陳知行和Christian Jüngst為本文的共同通訊作者。此外，本工作還得到哥廷根大學(xué)/馬克斯·普朗克研究所Stefan Jakobs課題組的合作支持。陳知行課題組自2018年建立以來(lái)，一直致力于研發(fā)新型熒光探針，努力打造國(guó)際領(lǐng)先的系列尖端成像試劑，助力細(xì)胞生物學(xué)與未來(lái)成像技術(shù)的交叉融合與協(xié)同發(fā)展。
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