細胞膜也稱質膜，是分隔細胞質與細胞周圍環(huán)境的一層膜結構。磷脂雙分子層是構成細胞膜的基本骨架。在水環(huán)境中，磷脂分子的疏水尾部相互聚集，親水頭部則朝向外側形成雙分子層結構。一些生理生化過程如壓力、機械性損傷和化學變化等會引起細胞膜損傷。雖然膜損傷會導致細胞死亡，但這并非是一個不可逆過程。一般來講，通常帶有電荷的基團如磺酸鹽等會降低分子的透膜性。帶電荷的成像探針通常會被用于檢測細胞膜的完整性以區(qū)分細胞的生存狀態(tài)。比如，Trypan Blue是一種四磺化陰離子親水染料，不易通過細胞膜，可用來判斷細胞的健康狀態(tài)。Propidium iodide（PI）是一種非滲透膜的紅色熒光染料。PI不能通過活細胞膜但可以穿透受損細胞，因此通常用于鑒定細胞的活力并常被用于熒光顯微鏡和流式細胞儀當中（Figure 1a）。因此，發(fā)展可以檢測細胞膜完整性的小分子探針對于修復受損細胞至關重要。本文中，作者發(fā)展了檢測膜損傷的熒光探針（Figure 1b），該探針能夠實現(xiàn)1）低背景熒光、免洗和免減影成像；2）區(qū)分細胞膜損傷細胞；3）受損細胞膜的特異性成像和4）高亮度的窄譜帶多色熒光成像。該探針的設計思路對于研究如何將藥物選擇性地運送到受損細胞中并對其進行診斷與治療具有重要意義。化學加——科學家創(chuàng)業(yè)合伙人，歡迎下載化學加APP關注。
Figure 1.非滲透型細胞探針
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
作者合成了新型含磺酸鹽的分子H2-FS1，該分子的激發(fā)和發(fā)射波長分別位于500 nm和525 nm?；诖?，作者又設計合成了熒光探針i2-FS1和a2-FS1（Figure 2a）。在共聚焦成像實驗中，探針i2-FS1，a2-FS1和H2-FS1由于其含有磺酸鹽基團而被細胞“排斥”，展現(xiàn)出較強的細胞外熒光信號（Figure 2b-c）。相比之下，含有酯基的i2-FS0和i2-FS1在細胞內的熒光強度相當。當熒光分子的基團被雙重O-?；?，修飾一個磺酸鹽基團不足以被細胞排斥。a2-FS1的細胞外熒光強度低于i2-FS1，說明異丁酸的親脂性促進了分子被細胞吞噬。流式細胞實驗中的單峰數(shù)據也再次證明了以上觀點（Figure 2d）。
Figure 2. 不同種類探針染色健康細胞的熒光圖像
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
為了調節(jié)分子對膜的透過性，作者合成了第二代含酯基探針（Figure 3a），最終分別得到了含有甲基（iMe-FS1），氨基（iEM-FS1）和磺酸鹽基團（iPS-FS2）的分子（Figure 3a-b）。其中，含雙磺酸鹽基團的分子iPS-FS2由于極性基團的存在而被細胞排斥，幾乎沒有細胞內熒光信號（Figure 3c，d）。作者通過誘導膜損傷以研究探針在受損細胞中的攝取和激活行為，共聚焦成像結果表明所有磺酸化的探針具有更高的細胞內熒光信號，但只有iPS-FS2最適合用于對受損細胞的免洗成像（Figure 3e-h）。
Figure 3. 探針染色受損細胞的熒光圖像
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
在膜損傷的軸突組織模型中，MDG1探針被健康的細胞所“排斥”，但是卻能夠對AAPH-受損細胞進行選擇性染色（Figure 4a，b）。因此，基于膜電荷的差異，二磺酸化結構的酯酶探針MDG1可以高靈敏度地檢測膜損傷。在進入細胞后，MDG2比MDG1更具有水解穩(wěn)定性，更能有效地被硫醇“分解”，在受損細胞具有很高的熒光強度。因此，MDG系列探針為區(qū)分受損細胞提供了合成簡單、性質靈活可調的小分子平臺（Figure 4c-e）。
Figure 4. 探針對受損細胞的細胞膜成像
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
鐵死亡的主要機制是在二價鐵或酯氧合酶的作用下，催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質過氧化，從而誘導細胞死亡。BODIPY是一種用于鐵死亡研究的常用分子（Figure 5f）。非氧化-還原依賴性的MDG1探針可以直接反映膜的完整程度。作者利用T細胞研究了MDG1能否用于鐵死亡過程的成像。流式細胞數(shù)據表現(xiàn)出明顯的增強（Figure 5a-e），與BODIPY-C11指示的過氧化程度相符（Figure 5f-k）。
Figure 5. 探針檢測鐵死亡過程中的膜損傷
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
最后，作者用AAPH試劑破壞軸突組織后進行成像，Propidium iodide（PI）并不能區(qū)分受損的軸突（Figure 6a），但MDG1能夠選擇性地示蹤受損軸突（Figure 6b），正常組織未發(fā)現(xiàn)有熒光信號（Figure 6c）。在果蠅胚胎的活體模型染色成像中，一般能夠觀察到DNA靶向的SYTOX57或者PI等非細胞滲透型染料的積累（Figure 6d）。同時，作者對比了細胞核靶向染料SYTOX Green和MDG1對受損胚胎的成像效果（Figure 6e-f），MDG1被證實具有良好的光學穩(wěn)定性和靶向性。
Figure 6. 探針檢測活體內軸突和壞死組織中的膜損傷
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
總結
德國慕尼黑大學Oliver Thorn-Seshold教授團隊通過在分子設計中利用電荷和極性基團的巧妙結合發(fā)展了用于細胞膜成像的探針“分子平臺”。開發(fā)了模塊化熒光探針，顯示受損細胞的整個細胞質體積，具有接近零的背景熒光，因此不需要洗滌。相比于傳統(tǒng)受損細胞的成像染料，該MDG系列探針可以實現(xiàn)對受損細胞的細胞膜的高分辨率免洗熒光成像，并可以無損追蹤和量化一些生理變化過程中細胞膜的通透性。隨著化學、生物學和醫(yī)學學科的不斷發(fā)展，細胞膜熒光探針的應用范圍越來越廣泛，對于了解細胞的生命活動和疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
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