TEV蛋白酶具有很強(qiáng)的位點(diǎn)特異性，嚴(yán)格識(shí)別七肽序列EXXYXQ↓（G/S），切割位點(diǎn)在谷氨酰胺和甘氨酸/絲氨酸之間。普遍應(yīng)用的七肽序列為：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly。

可把His、MBP或GST等標(biāo)簽設(shè)計(jì)在融合蛋白的N端，并在標(biāo)簽與目的蛋白之間設(shè)計(jì)加入上述七肽序列，在His、MBP或GST標(biāo)簽被酶切后，在目的蛋白的N端僅有一個(gè)額外的Gly/Ser氨基酸殘基，從而最大限度地減少了對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。

TEV蛋白酶的最佳酶切溫度是30oC，但在實(shí)際操作過程中，為盡量保留目的蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性，可以在4oC用TEV蛋白酶酶切過夜。TEV蛋白酶在pH 6.0-9.0范圍內(nèi)具有活性，而當(dāng)pH小于或等于5時(shí)，會(huì)失去酶活性。