背景[1-4]
高純質(zhì)粒小提試劑盒用于高純度質(zhì)粒DNA的小量制備與純化。菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低pH處理，質(zhì)?？蓮木w中釋放出來(lái)，并特異、高效地被離心柱硅膠膜（Spin Columns PA）吸附。通過(guò)去蛋白液（Buffer PD）和漂洗液（Buffer PW）的清洗可去除蛋白及其他雜質(zhì)，在低鹽、高pH條件下洗脫，最后得到高純度的質(zhì)粒DNA。
使用本試劑盒可從1~5 ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液中純化得到高達(dá)20 ug的高純度質(zhì)粒DNA，可在30 min之內(nèi)完成提取任務(wù)。所得質(zhì)?？芍苯佑糜诿盖?、轉(zhuǎn)化、PCR、測(cè)序、低敏感細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染等各種常規(guī)分子生物學(xué)操作。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.快速：步驟少，操作簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間。
2.簡(jiǎn)便：離心吸附柱不需要預(yù)平衡，漂洗液Buffer PW和去蛋白液Buffer PD不需要另加乙醇，即開(kāi)即用。
3.純度高：所得質(zhì)?？芍苯佑糜诿盖?、轉(zhuǎn)化、PCR、測(cè)序、低敏感細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染等各種常規(guī)分子生物學(xué)操作。
操作步驟
1.取1-5 ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，室溫12,000 rpm離心1 min，盡量將上清去除干凈。
2.加入250 ul Buffer P1，用槍頭充分吹打使菌體重懸均勻。
3.加入250 ul Buffer P2，溫和顛倒混勻6-8次，直到溶液變得清亮粘稠。
4.加入350 ul Buffer P3，立即溫和顛倒混勻6-8次，可見(jiàn)白色沉淀物產(chǎn)生，室溫靜置2 min，然后12,000 rpm離心3-5 min。
5.小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱Spin Columns PA中，靜置2 min，讓質(zhì)粒DNA與吸附柱中的硅膠膜充分結(jié)合。12,000 rpm離心0.5-1 min，棄收集管中的廢液。
6.向吸附柱中加入500 ul去蛋白液，12,000 rpm離心1 min，棄收集管中廢液。
7.加入500 ul的Buffer PW，室溫12,000 rpm離心0.5-1 min，棄收集管中廢液。
8.重復(fù)步驟7一次。
9.室溫12,000 rpm離心2 min，甩干殘留液體。
10.將離心吸附柱Spin Columns PA置于一個(gè)新的1.5 ml塑料離心管（自備）中，加入50-100 ul的Buffer EB，室溫放置2 min。12,000 rpm離心1 min，離心管底溶液即質(zhì)粒DNA。
應(yīng)用[5]
可用于質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1的發(fā)現(xiàn)研究：
將黏菌素耐藥性質(zhì)粒(p HNSHP45)轉(zhuǎn)移到受體菌中,接合頻率高達(dá)10-1~10-3,且p HNSHP45質(zhì)粒能通過(guò)接合或轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入肺炎克雷伯菌中,并介導(dǎo)黏菌素耐藥。通過(guò)高通量測(cè)序獲得該質(zhì)粒全序列,發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒全長(zhǎng)為62105bp,其G+C為43.0%,具有典型的Inc I2型質(zhì)粒骨架,并發(fā)現(xiàn)一個(gè)1626bp的開(kāi)放閱讀框與插入序列ISAp I1相連,推測(cè)此為該質(zhì)粒從外源獲得的序列,該基因被命名為mcr-1。
氨基酸序列分析結(jié)果顯示MCR-1與磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶有60%左右的相似性,細(xì)菌脂質(zhì)A的ESI-MS分析結(jié)果證實(shí)了MCR-1功能,即通過(guò)修飾細(xì)菌細(xì)胞膜上的脂質(zhì)A而介導(dǎo)對(duì)黏菌素耐藥。對(duì)原菌SHP45和接合子進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn),采用S1-PFGE和雜交的方法檢測(cè)該質(zhì)粒的穩(wěn)定性,分別在含黏菌素和不含黏菌素的LB溶液傳代培養(yǎng)14代,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒p HNSHP45仍能夠穩(wěn)定地存在接合子和原菌SHP45中。
首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1,mcr-1位于接合性Inc I2型質(zhì)粒上,與插入序列ISAp I1相連。MCR-1屬于磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶,通過(guò)修飾細(xì)菌細(xì)胞膜上脂質(zhì)A而介導(dǎo)對(duì)黏菌素的耐藥。mcr-1基因已在食品動(dòng)物和動(dòng)物性食品大腸桿菌中廣泛傳播,且該基因位于接合性質(zhì)粒上,極易傳播擴(kuò)散,從分子機(jī)制上解釋了目前國(guó)內(nèi)多粘菌素耐藥性迅速升高的原因,為正確評(píng)估多粘菌素藥物在動(dòng)物中的使用提供依據(jù)。
參考文獻(xiàn)
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