背景^[1-6]

MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞是將小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。

原代MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞具體操作：

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺(tái)中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開(kāi)，用另外一組剪刀、鑷子剪開(kāi)腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。

3.用200 ul的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4℃1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分消化。

4. 將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細(xì)胞沉淀用15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3x10細(xì)胞)。細(xì)胞懸浮于15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7.24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

8.細(xì)胞長(zhǎng)滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，作者一般不超過(guò)五分鐘)，按1:5傳代。

9.細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

注意事項(xiàng)：1.原代培養(yǎng)，一定要避免污染。2.MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)原代培養(yǎng)可應(yīng)用于：（1）細(xì)胞保種；（2）分子生物學(xué)研究；（3）基因治療相關(guān)研究。

應(yīng)用^[7][8]

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)與生長(zhǎng)特性的研究：

許多胚胎干（ES）細(xì)胞培養(yǎng)方案依賴于單層原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF飼養(yǎng)細(xì)胞）的使用。MEF細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮兩個(gè)重要作用：它們會(huì)向培養(yǎng)基中分泌幾種有助于維持其多能性的重要生長(zhǎng)因子，并為ES細(xì)胞生長(zhǎng)提供細(xì)胞基質(zhì)。EmbryoMax™系列PMEF小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞為研究人員提供了ES細(xì)胞培養(yǎng)的便捷解決方案，省去了耗時(shí)的飼養(yǎng)細(xì)胞分離和制備過(guò)程。

這些細(xì)胞來(lái)源于第13天的小鼠胚胎，被冷凍成單獨(dú)西林瓶，每瓶大約含有5-6 x 106個(gè)成纖維細(xì)胞，并以每組5瓶、每瓶傳代數(shù)不同（P1-P3）的形式出售。有幾種品種可供選擇，包括耐藥，抑制生長(zhǎng)，和未經(jīng)絲裂霉素-C處理的小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)層(feeder layer)是特定的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、子宮上皮細(xì)胞、胎兒睪丸細(xì)胞等)經(jīng)絲裂霉素-C阻斷有絲分裂處理后制成的單層細(xì)胞。

目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均采用小鼠成纖維細(xì)胞(MEF和STO細(xì)胞)作為飼養(yǎng)層分離培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞(ES)。飼養(yǎng)層的存在不僅為ES細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供了一個(gè)穩(wěn)定的外環(huán)境，同時(shí)也維持了ES細(xì)胞無(wú)限增殖與分化的特性。然而衰老的飼養(yǎng)層會(huì)對(duì)ES細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響，死亡的飼養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)釋放一些DNA碎片和溶酶體的酶進(jìn)入培養(yǎng)液，干擾了ES細(xì)胞的生長(zhǎng)和正常核型的維持。

利用3種不同的冷凍方法對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行凍存，篩選出的冷凍方案。并對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在連續(xù)傳代過(guò)程中細(xì)胞活力以及細(xì)胞骨架所發(fā)生的變化進(jìn)行追蹤觀察，確定制作飼養(yǎng)層的時(shí)機(jī)。本試驗(yàn)首先以12.5d的昆明小鼠胚胎和STO細(xì)胞為材料，對(duì)MEF進(jìn)行了分離培養(yǎng)。并通過(guò)3種冷凍方法對(duì)STO細(xì)胞和MEF細(xì)胞分別進(jìn)行冷凍，即方法A為將細(xì)胞在冰箱中平衡1h后放入-20℃冰箱中過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中；方法B為將細(xì)胞迅速放入-70℃冰箱過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中；方法C為將細(xì)胞置于液氮面上5-10cm處薰蒸20min后緩緩降入液氮中。

細(xì)胞凍融后再以存活率(臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn))為主，輔以細(xì)胞相對(duì)活力測(cè)定(MTT法檢測(cè))和冷凍前后的細(xì)胞形態(tài)比較，對(duì)這3種方法的冷凍效果作以比較。以其為小鼠成纖維細(xì)胞的保存提供依據(jù)。然后對(duì)STO細(xì)胞和MEF細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)變化，采用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活力，并繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；對(duì)不同代次的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，觀察其細(xì)胞骨架的變化。

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