背景[1-6]
T4-DNA連接酶一種封閉DNA鏈上切口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵。T4 DNA連接酶可催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合的反應(yīng)，需ATP作輔酶，不僅可以催化粘性末端之間或平滑末端之間的DNA的連接，也可以催化DNA與RNA之間以及少數(shù)RNA之間的連接。可應(yīng)用于在粘性末端或平末端連接雙鏈DNA分子，也可應(yīng)用于修補雙鏈DNA、RNA或DNA RNA雜交體上的缺口。
T4DNA連接酶作用機制：分子生物學(xué)試驗中主要采用T4DNA連接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應(yīng)。T4 DNA連接酶是一單鏈多肽，分子量為68,000道爾頓，它能催化雙鏈DNA上相鄰的3ˊ羥基和5ˊ磷酸末斷形成磷酸二脂鍵。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6個片斷均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA連接酶作用下，可連接成原來的線狀DNA。
T4-DNA連接酶即T4 DNA連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP作為輔助因子T4 DNA Ligase即T4 DNA連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP作為輔助因子。同時T4 DNA連接酶可以修補雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合物上的單鏈缺口(single-strand nicks)。T4DNA連接酶在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。
T4DNA連接酶是經(jīng)原核表達(dá)，柱層析純化獲得的高純T4DNA接酶，SDS-PAGE顯示為一條62kD的蛋白條帶。本品附帶10xLigationBuffer含有ATP。適用于DNA片斷接、克隆等各種反應(yīng)。連接條件：
推薦在10~20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行接反應(yīng)，反應(yīng)中DNA濃度可達(dá)1mM（1kbDNA約1mg/ml）。首先混合要接的DNA片段，加入10×Ligase Buffer至終濃度為1×，再加入適量T4 DNA Ligase混勻。最適連接溫度為16℃。粘末端連接效率較高，加入0.2~1μl T4 DNA Ligase,可在室溫或16℃反應(yīng)1~3小時完成反應(yīng)；平末端連接效率較低，加入1μl T4 DNA Ligase，通常需要在16℃或4℃過夜完成反應(yīng)。
注意事項：
1)10×LigaseBuffer含有ATP，使用前應(yīng)在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。
2)T4 DNA Ligase對熱敏感，容易失活。使用時請放置冰上，用后立即置冰箱中冷凍保存。
3)如需在接反應(yīng)后滅活T4 DNA Ligase，可于65℃孵育10min即可。
4)10×LigaseBuffer不宜反復(fù)凍融，建議分裝。
應(yīng)用[7][8]
1.粘性末端或平末端雙鏈DNA的連接；
2.雙鏈寡核苷酸接頭與雙鏈DNA連接；
3.雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA復(fù)合體中缺口的修復(fù)；
4.連接酶介導(dǎo)的RNA檢測；
5.位點特異性突變；擴增片段長度多態(tài)性。
DNA連接酶對單個核苷酸差異具有很強的鑒別能力,其核心在于它可以把與模板完全配對的兩相鄰寡核苷酸片段連接起來,如果連接處出現(xiàn)一個堿基錯配,連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。以該酶為基礎(chǔ)的技術(shù)如空隙-連接酶鏈反應(yīng)(gap ligase chain reaction,Gap-LCR)和連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction,LDR)在低豐度基因單核苷酸差異檢測方面具有很強的應(yīng)用潛力。
在妊娠過程中母體血漿中存在游離胎兒DNA,這一發(fā)現(xiàn)為基于母體外周血的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷開辟了新的領(lǐng)域。胎兒DNA一半來自于母親,另一半來自于父親,目前已報道利用母體血漿DNA來檢測胎兒父系來源的致病基因,可應(yīng)用于父親為常染色體顯性遺傳病患者的胎兒無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷,而且將這種檢測方法應(yīng)用于父親為常染色體隱性遺傳病攜帶者的產(chǎn)前診斷,也可使50%的胎兒避免了傳統(tǒng)的絨毛吸取或羊膜腔穿刺檢查。
但由于母體血漿總DNA量少,且在血漿總DNA中胎兒DNA所占的比例甚微,母體等位DNA片段可干擾胎兒DNA的檢測,因此對這種低豐度胎兒DNA檢測必須采用高靈敏度和高特異性的分析系統(tǒng)。點突變或單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的檢測是目前DNA分子診斷中的主要研究內(nèi)容,對母體血漿中的這些單核苷酸差異的檢測在技術(shù)上要求更高,目前所用的檢測方法仍不夠理想。DNA連接酶對單個核苷酸差異具有很強的鑒別能力,其核心在于它可以把與模板完全配對的兩相鄰寡核苷酸片段連接起來,如果連接處出現(xiàn)一個堿基錯配,連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。
參考文獻(xiàn)
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