背景[1-6]
PiRNA定量PCR檢測(cè)可以對(duì)piRNA的總體表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。三個(gè)物種的piRNA序列都來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并且使用UCSC Blat技術(shù)在HG19,MM9和RN4數(shù)據(jù)庫(kù)中分別進(jìn)行染色體定位（map）。我們采用恰當(dāng)?shù)牟呗詠?lái)挑選探針，然后使用雙重方法（duplex method）設(shè)計(jì)60 mer的反義寡核苷酸探針。
piRNA（Piwi-interacting RNA）是從哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞中分離得到的一類(lèi)非編碼小RNA。成熟的piRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約26-32nt的單鏈小RNA分子。在小鼠睪丸內(nèi)只存在幾百種不同的miRNA，而piRNA卻至少有5萬(wàn)種。piRNA即使在近緣物種之間保守性也很差，在長(zhǎng)度、表達(dá)類(lèi)型和基因結(jié)構(gòu)上則與microRNA截然不同。
piRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為26～31nt單鏈的小RNA，大部分集中在29～30nt。piRNA的表達(dá)具有組織特異性，只存在于具有全能性的動(dòng)物細(xì)胞，如生殖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞等。piRNA通過(guò)與Piwi亞家族蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物（piRC）來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能（沉默轉(zhuǎn)錄基因過(guò)程，維持生殖系和干細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)翻譯和mRNA的穩(wěn)定性）。此外，piRNA在一些癌癥細(xì)胞中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，提示piRNA可能參與癌癥的發(fā)生，并可作為癌癥診斷和治療中的潛在生物標(biāo)記物。
PiRNA的沉默機(jī)制主要利用（1）通過(guò)轉(zhuǎn)錄自與轉(zhuǎn)座元件（TE）加工而成piRNA，并結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合TE抑制其轉(zhuǎn)錄；（2）通過(guò)編碼蛋白基因區(qū)轉(zhuǎn)錄加工成piRNA,與AGO3，AUB蛋白形成復(fù)合體抑制靶基因；（3）由基因3'UTR轉(zhuǎn)錄生成piRNA，并結(jié)合與PIWI,抑制靶基因；（4）從piRNA簇生成piRNA，并與AUB等蛋白相互作用起到抑制靶基因的目的。（5）另外，piRNA也被報(bào)道有起到高甲基化調(diào)控的協(xié)同調(diào)控行為。
piRNA的生成加工過(guò)程途徑（Biogenesis Pathway）主要分為二大類(lèi)：（a）轉(zhuǎn)錄自TE轉(zhuǎn)錄元件或piRNA簇的反義鏈經(jīng)過(guò)加工，加載到蛋白AUB或PIWI上形成功能piRNA。通常piRNA介導(dǎo)的piRISC復(fù)合體起到引發(fā)第二種生成加工途徑的激發(fā)作用。（b）通過(guò)AUB和AGO3蛋白的剪接體翠功能發(fā)生piRNA擴(kuò)增效應(yīng)（即Pingpong循環(huán)反應(yīng)）。
應(yīng)用[7][8]
PiRNA定量PCR檢測(cè)可用于PiRNA沉默轉(zhuǎn)錄基因過(guò)程；維持生殖系和干細(xì)胞功能的研究：
piRNA通路是近年來(lái)在多種動(dòng)物生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的小RNA通路,在配子生成、轉(zhuǎn)座子抑制及維護(hù)基因組的完整性方面發(fā)揮著重要的作用?；蚪M中的轉(zhuǎn)座現(xiàn)象可能會(huì)導(dǎo)致重要基因功能的缺失,在生殖細(xì)胞中,轉(zhuǎn)座子的頻繁活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致生殖細(xì)胞的凋亡,影響遺傳信息的傳遞,從而威脅物種的生存和繁衍。硬骨魚(yú)中轉(zhuǎn)座子的種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)哺乳動(dòng)物,其在基因組中的周轉(zhuǎn)頻率也更高。
piRNA通路基因作為在生殖系統(tǒng)中抵抗轉(zhuǎn)座侵?jǐn)_、保護(hù)基因組的衛(wèi)士,必然受到強(qiáng)大的選擇壓力。大部分硬骨魚(yú)都是通過(guò)體外受精進(jìn)行繁殖,生殖細(xì)胞通過(guò)持續(xù)的有絲分裂和減數(shù)分裂形成更多生殖細(xì)胞,piRNA通路基因必須應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)座帶來(lái)的持續(xù)威脅。因此,推測(cè)硬骨魚(yú)中piRNA通路基因和轉(zhuǎn)座子存在共進(jìn)化。調(diào)取了21個(gè)哺乳動(dòng)物和8個(gè)硬骨魚(yú)的18個(gè)基因的編碼區(qū)序列,這些基因包括miRNA/siRNA通路基因(Ago家族)和piRNA通路基因。
此外,克隆了黃鱔Ago家族及piRNA通路的9個(gè)基因。通過(guò)譜系間的選擇壓力分析,以miRNA/siRNA通路基因和β-actin作為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)piRNA通路基因在硬骨魚(yú)中加速進(jìn)化,同時(shí)在這些基因的功能域檢測(cè)到了大量的正向選擇位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)了piRNA通路基因在黃鱔中的進(jìn)化比其它硬骨魚(yú)更快,表達(dá)譜分析顯示這些基因在黃鱔三種性腺中高表達(dá),為進(jìn)化分析提供了佐證。
1.黃鱔Ago家族基因和piRNA通路基因的克隆通過(guò)設(shè)計(jì)兼并引物和RACE技術(shù),克隆了黃鱔Ago家族及piRNA通路的9個(gè)基因,包括Ago1、Ago2、Ago3a、Ago3b、Ago4、Piwill、Piwil2、Tdrdl及Prmt5。Ago基因是miRNA/siRNA通路的核心蛋白,在進(jìn)化分析中作為對(duì)照基因。通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)證實(shí)了克隆的黃鱔基因確實(shí)是該通路的基因。2.黃鱔Ago家族基因和piRNA通路基因的表達(dá)分析通過(guò)RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示,Ago家族基因在黃鱔組織中廣譜表達(dá),piRNA通路基因則主要在性腺中表達(dá)。
在黃鱔三種性腺中,piRNA通路基因的表達(dá)遠(yuǎn)高于Ago家族基因,提示它們?cè)邳S鱔配子生成和性腺分化中具有重要功能。構(gòu)建的Ago家族基因和Piwi家族基因的熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)這些基因主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。piRNA通路基因在性腺中的高水平表達(dá)說(shuō)明了其重要作用,從而為進(jìn)化分析得出的結(jié)論提供了佐證。
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