背景及概述^[1]

核酸外切酶(exonucleautomotive service engineers)在核酸水解酶中，是具有從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸作用的酶，總對(duì)單一核苷酸鏈作用，在剪切修飾反應(yīng)中起作用，與核酸內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)。可大致分為水解磷酸二酯鍵的3′端生成5′-單核苷酸的酶，及水解5′端生成3′-單核苷酸的酶。前者有蛇毒磷酸二酯酶及大腸桿菌核酸外切酶I、II和III等；后者有脾臟磷酸二酯酶、嗜酸乳桿菌(Lac-tobacillus acidophilus) 核酸酶。這些酶中還可以區(qū)別出從分子鏈的3′末端或5′末端開(kāi)始切斷和對(duì)單鏈DNA或雙鏈 DNA具有特異作用的酶?？衫眠@些酶水解方式的差異來(lái)分析核酸結(jié)構(gòu)。

T5核酸外切酶純化自含T5噬菌體D15基因質(zhì)粒的E.coli菌株，是核酸外切酶的一種，該酶能沿5′→3′方向降解DNA。它既能從5′末端起始消化，也能從線性或環(huán)狀雙鏈DNA的切刻或缺口處起始消化，但不能降解超螺旋雙鏈DNA。T5核酸外切酶還具有單鏈DNA核酸內(nèi)切酶活性。這些特性使得T5核酸外切酶常被用于消化DNA和基因克隆上。隨著基因克隆技術(shù)的普及，T5核酸外切酶市場(chǎng)需求量越來(lái)越大，而天然T5核酸外切酶的提取技術(shù)復(fù)雜、成本高、產(chǎn)率低。

制備^[1]

通過(guò)載體構(gòu)建將密碼子優(yōu)化的T5核酸外切酶基因克隆到 pGEX載體中，在低溫條件下通過(guò)與GST融合表達(dá)，來(lái)提高蛋白表達(dá)量和可溶性；T5核酸外切酶基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；T5核酸外切酶與GST在宿主菌中融合表達(dá)，融合表達(dá)蛋白為GST-T5 Exonuclease；融合表達(dá)蛋白含有GST標(biāo)簽，用GST柱子純化融合蛋白。圖1A是重組表達(dá)載體pGEX-T5核酸外切酶的質(zhì)粒圖譜。

下述實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)方法，如果無(wú)特殊說(shuō)明， 均屬于常規(guī)方法。

1、重組T5核酸外切酶原核表達(dá)載體pGEX-T5核酸外切酶的構(gòu)建：

以合成T5核酸外切酶基因?yàn)槟０?，用PCR的方法擴(kuò)增T5核酸外切酶編碼序列，

所用的正向引物為：

5’-CATGGGATCCGACGACGACGACAAGATGAGCAAATCGTGGGGGAAATTCAT-3’，

反向引物為：5’-CATGCTCGAGTCACTGTTCTGCAATTTCGA-3’；

在正向引物中有一個(gè)BamH I的酶切位點(diǎn)以及編碼腸激酶識(shí)別位點(diǎn)DDDDK的序列，反 向引物中有一個(gè)Xho I的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)的條件為：94℃熱變性一分鐘，55℃退火一分 鐘，72℃延伸90秒，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。pGEX和純化的PCR產(chǎn)物采用BamH I和Xho I進(jìn) 行雙酶切，然后將PCR酶切片段回收插入pGEX的多克隆位點(diǎn)。pGEX是一個(gè)在N端融合 GST-tag的原核表達(dá)載體。對(duì)重組表達(dá)載體pGEX-T5核酸外切酶進(jìn)行DNA測(cè)序，分析其閱讀 框和編碼序列的正確性。

按照方法中所述的步驟，將密碼子優(yōu)化的T5核酸外切酶基因克隆至GST編碼序列的下 游并與之處于同一閱讀框，為了便于釋放并純化野生型的T5核酸外切酶，本發(fā)明在GST-tag 和T5核酸外切酶基因之間設(shè)計(jì)并加入腸激酶的酶切位點(diǎn)，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了 融合蛋白pGEX-T5核酸外切酶的原核表達(dá)載體，閱讀框及DNA序列全部正確，其簡(jiǎn)圖參見(jiàn)圖 1A。

2.pGEX-T5核酸外切酶的表達(dá)：

將T5核酸外切酶融合蛋白表達(dá)載體pGEX-T5核酸外切酶轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E.coli  BL21(DE3)，挑取單克隆接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含50mg/l的氨芐青霉素)。待細(xì)菌長(zhǎng) 至OD600為0.6左右，加入終濃度為0.4mM的IPTG誘導(dǎo)T5核酸外切酶的表達(dá)。

16℃誘導(dǎo) 12個(gè)小時(shí)后收集菌體，處理后的菌體蛋白樣品跑12％SDS-PAGE，使用UVP white/ultraviolet  transilluminator對(duì)考馬斯亮蘭染色的凝膠進(jìn)行掃描記錄，采用專(zhuān)業(yè)分析軟件Grab-it 2.5和 Gelwork分析目的蛋白占菌體總蛋白的比例。本文中，可溶性定義為：可溶性的目的蛋白/總 的目的蛋白×100％。在IPTG誘導(dǎo)后，出現(xiàn)了一條約為64kD的蛋白條帶，和理論分子量大小 吻合，經(jīng)凝膠掃描灰度分析，T5核酸外切酶融合蛋白約占菌體總蛋白的15％左右(圖1B)，

3、蛋白的純化

收集一升發(fā)酵液的細(xì)胞，并用40ml冰浴的bufferA(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.5％  Triton-X100，10％甘油，pH8.0重懸，超聲裂解細(xì)胞，離心取上清，上清通過(guò)buffer A預(yù)平衡 的GST親和柱，上樣完畢用buffer A充分洗滌至基線，而后用buffer B(50mM Tris-HCl，20mM  Reduced Glutathione，10％甘油，pH8.0)洗脫目的蛋白。

將結(jié)合了GST-T5核酸外切酶透析后用EK酶切，按照EK(mg)∶目標(biāo)蛋白(mg)＝1∶10000 的比例將EK加入融合蛋白溶液中開(kāi)始酶切反應(yīng)，酶切條件為4℃，16小時(shí)，酶切溶液通過(guò) GST親和柱收集流出液，流出液進(jìn)一步經(jīng)強(qiáng)陰離子交換吸附層析Q-Sepharose純化。純化后 的酶采用Micro BCA試劑盒定量及凝膠灰度掃描分析。

通過(guò)GST親和層析、EK酶切以及離子交換層析純化，得到了野生型的不帶任何親和標(biāo) 簽的T5核酸外切酶。GST親和層析去除了絕大部分菌體雜蛋白，用腸激酶酶切，將不帶任何 冗余氨基酸的T5核酸外切酶與GST標(biāo)簽分離開(kāi)，最后通過(guò)離子交換層析去除EK和痕量的 DNA，最終從一升發(fā)酵液中得到了約8mg的野生型T5核酸外切酶(純度約95％)。12％ SDS-PAGE分析表明，純化的T5核酸外切酶與理論分子量31.6kD相符(圖2B)。

4.T5核酸外切酶的活性檢測(cè)方法

1單位T5核酸外切酶指在50μl反應(yīng)體系，37℃反應(yīng)30分鐘，能從雙鏈DNA底物上催化產(chǎn)生1nmol的酸可溶性脫氧核糖核苷酸所需要的酶量。

主要參考資料

[1] CN201410382116.6 一種T5核酸外切酶在大腸桿菌中的制備方法