背景^[1-3]

PAK6抗體是一種特異性識(shí)別和結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子PAK6的抗體。通過(guò)使用PAK6抗體，研究人員可以檢測(cè)和定量PAK6在細(xì)胞或組織樣品中的表達(dá)水平，進(jìn)而了解其在相關(guān)生物過(guò)程中的功能和調(diào)控機(jī)制。常見(jiàn)的應(yīng)用包括免疫印跡（Western blotting）、免疫組化（immunohistochemistry）和免疫熒光染色（immunofluorescence）等。

PAK6基因編碼p21刺激的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一個(gè)成員，該激酶家族包含一個(gè)氨基末端Cdc42/Rac相互作用結(jié)合(CRIB)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基末端激酶結(jié)構(gòu)域。這些激酶在許多細(xì)胞過(guò)程中起作用，包括細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞凋亡和絲裂原活化蛋白(MAP)激酶信號(hào)通路。由該基因編碼的蛋白質(zhì)與雄激素受體(AR)相互作用并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。該基因表達(dá)的變化與前列腺癌有關(guān)?？勺兗艚訉?dǎo)致多個(gè)轉(zhuǎn)錄本變體。

PAK6抗體

PAK6A抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（PAK6A抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(PAK6A抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

PAK6抗體可以用于AR、PAK6、P53在膀胱癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

雄激素受體(androgen receptor,AR)、P21活化激酶6(p21-activated kinase 6,PAK6)、P53基因與人類癌癥密切相關(guān),但其在膀胱癌中的生物學(xué)作用尚未完全展示。本研究旨在探討AR、PAK6、P53在膀胱癌及膀胱正常粘膜組織中的表達(dá)及差異性;分析三者之間的關(guān)系,進(jìn)一步揭示三者在膀胱癌發(fā)生、進(jìn)展中的相互作用;探討三者的表達(dá)與膀胱癌腫瘤數(shù)量、臨床分期、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系;驗(yàn)證AR、PAK6、P53在膀胱癌中作為腫瘤分子標(biāo)記物的潛在價(jià)值。

方法:(1)采用PAK6抗體免疫組化染色方法(Envision)檢測(cè)膀胱癌組與膀胱正常粘膜組中AR、PAK6、P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。分析AR、PAK6、P53蛋白表達(dá)在膀胱癌中的臨床病理特征,以及膀胱癌中AR與PAK6、P53蛋白之間的相關(guān)性。(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)正常膀胱細(xì)胞株(SV-HUC-1)和兩種膀胱癌細(xì)胞株(T24、BIU-87)中PAK6 m RNA的表達(dá)水平,構(gòu)建PAK6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。(3)采取瞬轉(zhuǎn)法將構(gòu)建好的PAK6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,即為PAK6過(guò)表達(dá)組(overexpression group,OE),轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對(duì)照組(negative control group,NC),用qPCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。(4)CCK-8、細(xì)胞劃痕檢測(cè)PAK6上調(diào)后對(duì)BIU-87膀胱癌細(xì)胞株增殖和遷移水平的影響。(5)qPCR方法檢測(cè)PAK6上調(diào)后對(duì)BIU-87細(xì)胞株中AR m RNA、P53 m RNA的表達(dá)的影響。(6)PAK6抗體Western blotting法檢測(cè)PAK6上調(diào)后對(duì)BIU-87細(xì)胞株中AR、P53蛋白表達(dá)量的影響。

結(jié)果:(1)通過(guò)PAK6抗體免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膀胱癌組中AR、PAK6、P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為:78.1%(50/64)、45.5%(20/64)、70.3%(45/64),膀胱正常粘膜組中AR、PAK6、P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為:25%(16/64)、84.4(54/64)、43.8%(28/64),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即AR、P53蛋白在膀胱癌組中的表達(dá)水平明顯高于正常粘膜組,PAK6蛋白在膀胱癌組中的表達(dá)水平低于正常粘膜組。(2)AR蛋白的表達(dá)與膀胱癌病理分級(jí)、腫瘤分期、轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。PAK6蛋白的表達(dá)與膀胱癌復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)。P53蛋白的表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤分期、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。(3)對(duì)膀胱癌組織中AR、PAK6、P53蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)分析,AR蛋白與PAK6蛋白在膀胱癌中的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(rb=-0.525,P<0.01),AR蛋白與P53蛋白在膀胱癌中的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(rb=-0.711,P<0.01)。

參考文獻(xiàn)

[1]Advances in Diagnosis and Therapy for Bladder Cancer[J].Hu Xinzi;Li Guangzhi;Wu Song.Cancers.2022

[2]p53 signaling in cancer progression and therapy.[J].Marei Hany E;Althani Asmaa;Afifi Nahla;Hasan Anwarul;Caceci Thomas;Pozzoli Giacomo;Morrione Andrea;Giordano Antonio;Cenciarelli Carlo.Cancer cell international.2021

[3]Bladder Cancer:Current Challenges and Future Directions[J].Dobruch Jakub;Oszczud?owski Maciej.Medicina.2021

[4]Loss of androgen receptor promotes HCC invasion and metastasis via activating circ-LNPEP/miR-532–3p/RAB9A signal under hypoxia[J].Ouyang Xiwu;Yao Lei;Liu Guodong;Liu Shiqing;Gong Liansheng;Xiao Yao.Biochemical and Biophysical Research Communications,2021

[5]梁聰聰.AR、PAK6、P53在膀胱癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究[D].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),2023.