染料分子具有種類繁多，良好的熒光性能等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的發(fā)光材料，是一種常用的自組裝構(gòu)筑基元。染料分子中通常含有多種功能性基團(tuán)和雜芳環(huán)或芳環(huán)等π共輒結(jié)構(gòu)，是構(gòu)筑熒光自組裝體的理想構(gòu)筑基元。常用的染料分子有羅丹明B、低聚芳經(jīng)磺酸鈉等。染料分子通常能夠在多種弱相互作用力如范德華力、T-箕堆積、靜電作用和氫鍵的驅(qū)動下，發(fā)生自組裝聚集行為。^[1]

2',7'-二氯熒光素二乙酸酯是什么？

越來越多的實(shí)驗(yàn)研究，就是利用化學(xué)熒光指示劑即熒光探針：2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(2',7'-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)檢測細(xì)胞內(nèi)的活性氧，從而研究活性氧在各種病理及生理現(xiàn)象中的變化。2',7'-二氯熒光素二乙酸酯通常被作為一種酶作用底物，來檢測細(xì)胞內(nèi)的活性氧以及各種活性氧之間的級聯(lián)誘導(dǎo)變化。它是一種脂溶性物質(zhì)，可以穿過細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成一種非熒光物質(zhì)二氯二氫熒光素(2",7'-Dichlorofluorescin ,DCFH)，DCFH繼而可以被細(xì)胞內(nèi)的各種活性氧所氧化，轉(zhuǎn)變成一種可以產(chǎn)生熒光信號的物質(zhì)即二氯熒光素(2',7'-Dichlorofluorescein , DCF)，DCF所產(chǎn)生的熒光信號可以被特定的儀器檢測到，比如激光共聚焦掃描顯微鏡、流式細(xì)胞儀、分光光度計等。細(xì)胞內(nèi)活性氧的量與DCF的熒光信號成比例，所以可以通過檢測這種熒光信號的變化，來了解細(xì)胞內(nèi)的活性氧的變化情況，是一種間接的檢測活性氧的方法。有文獻(xiàn)報道：所得到的DCF熒光圖像并不是被某種單一的活性氧氧化所產(chǎn)生，而是總的活性氧的氧化能力的反映。所以用這種熒光指示劑測定細(xì)胞內(nèi)的活性氧，反映的是細(xì)胞內(nèi)所有活性氧的總的氧化能力，并不是某種特定的活性氧的氧化能力。^[2]

2',7'-二氯熒光素二乙酸酯的應(yīng)用

ROS包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產(chǎn)物過氧化物等，ROS廣泛參與體內(nèi)生理反應(yīng)。HDCFDA又名2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorodihydrofluorescein,DCFH-DA)，是一種熒光探針指示劑，但是DCFH-DA本身無熒光，而是通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，留在細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)ROS的作用下，DCFH被氧化，生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物2',7'-二氯熒光素(2',7'-dichlorofluorescein,DCF），通過檢測DCF的熒光來檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。^[3]

陳育婷等采用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′- dichlorofluorescin diacetate， DCFH-DA）探針檢測發(fā)現(xiàn)，Pt-BIC在550 nm光照條件下能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生研究工作不僅為新型鉑類藥物的設(shè)計和開發(fā)提供了新策略，也為癌癥治療帶來新希望。^[4]

ROS是指在生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的、含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱。ROS在維持正常體內(nèi)平衡的情況下具有重要的生物學(xué)功能，參與宿主防御和細(xì)胞信號傳導(dǎo)。然而，當(dāng)ROS水平超過細(xì)胞通過自然抗氧化機(jī)制的中和能力時，會引發(fā)氧化應(yīng)激，與多種慢性炎癥性疾病有關(guān)。通過 2',7'-二氯熒光素二乙酸酯 (DCFH‐DA) 法測定 ROS 水平，發(fā)現(xiàn)黃芩提取物在不同濃度下均對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚ROS 相對熒光強(qiáng)度產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，表明其具有抗氧化的作用。^[5]

體外培養(yǎng)Huh-7細(xì)胞，設(shè)置空白對照組、人參皂苷辛酸酯Rh2-O藥物組及陽性對照組（米托蒽醌處理），CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞活力和凋亡，ELISA及化學(xué)發(fā)光法分別檢測細(xì)胞上清高遷移率族蛋白1（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP）含量，免疫熒光法檢測細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白（CRT）的膜外翻，熒光探針2',7'-二氯熒光素二乙酸酯檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

Rh2-O對Huh-7細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，利用熒光探針DCFH-DA對細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行檢測，與對照組相比，藥物組檢測出大量綠色熒光(P<0.05,圖5)。說明Rh2-O可誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，刺激細(xì)胞氧化應(yīng)激。

PMA是一種典型的具有致炎作用的小分子化合物,能明顯升高巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。而2',7'-二氯熒光素二乙酸酯 DCFH-DA能夠在進(jìn)入胞內(nèi)后，被水解從而保留在胞內(nèi)，被氧化為具有綠色熒光的 DCF，熒光強(qiáng)度與ROS水平呈正比。圖1顯示，在PMA誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，但是經(jīng)過OXbCD NP處理，細(xì)胞ROS量明顯降低。說明OXbCD NP具有良好的抵抗PMA所致氧化應(yīng)激的能力。^[6]

ROS包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，可參與細(xì)胞生長增生、發(fā)育分化、衰老和凋亡等生理及病理過程。為初步了解抑制H₂O₂誘導(dǎo)的Muller細(xì)胞凋亡的途徑，本研究應(yīng)用DCFH-DA檢測NBP高表達(dá)對H₂O₂誘導(dǎo)的Muller細(xì)胞ER中ROS的表達(dá)影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H₂O₂刺激后Muller細(xì)胞的ROS水平明顯增高，而給予NBP丁基苯酞作用后，細(xì)胞中ROS水平顯著下降。提示NBP可抑制氧化應(yīng)激水平。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后被細(xì) 胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。在ROS存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，檢測熒光DCF可了解 細(xì)胞內(nèi)ROS水平。綠色熒光的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成 正比。結(jié)果顯示，NBP作用后可有效緩解ER中ROS的 堆積，進(jìn)而下調(diào)ER應(yīng)激水平。^[7]

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