背景及概述[1]
肝病與腫瘤，在我國(guó)均屬于高發(fā)疾病。腫瘤特異性免疫治療的研究持續(xù)發(fā)展過(guò)程中，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞因?qū)δ承┎《?、腫瘤細(xì)胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用而被研究者們發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，亦叫TC細(xì)胞(cytotoxic T cell)，是白細(xì)胞的亞群，為一種特異T細(xì)胞，專(zhuān)門(mén)分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用。與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。Helmich等人的研究表明，CTL無(wú)論在體外，還是在體內(nèi)正常生理狀態(tài)下，都能夠?qū)Ρ磉_(dá)與其TCR匹配的抗原的腫瘤有明顯的殺傷效果。
使用方法[1]
體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法具體步驟為：
步驟一：配置培養(yǎng)基，每1mL X-VIVO 15無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)含IL-21000IU，包被培養(yǎng)瓶，用50g/mL CD3預(yù)處理T225cm2帶有空氣濾膜的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，4℃包被過(guò)夜后，備用；
步驟二：取樣，取100mL靜脈血，其中活率≥90％，用于制備單個(gè)核細(xì)胞，取等量淋巴細(xì)胞分離液，小心轉(zhuǎn)移靜脈血至分離液之上，輕柔操作避免打破交界液面，采用離心機(jī)進(jìn)行離心，在1800×rpm離心15min，小心吸取中間白膜層，即單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新離心管中；
步驟三：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞用生理鹽水浸泡，采用離心機(jī)進(jìn)行離心在1800×rpm，離心10min，充分漂洗3遍；
步驟四：將分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞用一定體積的X-VIVO 15無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)中內(nèi)含IL-2，終濃度1000IU/mL，按1-2.0×106個(gè)/mL的濃度接種于包被過(guò)的T225cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中內(nèi)含CD3，終濃度50g/mL，放置在37℃下，在5％±0.5％CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
步驟五：第4天向T225cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)入步驟二中等體積X-VIVO 15無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)含IL-2，終濃度1000IU/mL，做好標(biāo)記，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
步驟六：第6天，觀察培養(yǎng)基顏色并計(jì)數(shù)，向T225cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)入150mL 37℃預(yù)熱的X-VIVO 15無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)含IL-2，終濃度1000IU/mL，混勻，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
步驟七：第7天擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞處于1.0×106個(gè)/mL左右時(shí)最適宜進(jìn)行擴(kuò)增操作，數(shù)量過(guò)低應(yīng)將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，表面消毒，放入生物安全柜中，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，混勻，均分至5個(gè)T225cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶補(bǔ)足37℃預(yù)熱的X-VIVO 15無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)含IL-2，終濃度1000IU/mL，至200mL，混勻，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
步驟八：第13天向5個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)入37℃預(yù)熱的X-VIVO 15無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)含IL-2，終濃度1000IU/mL，至200mL，混勻，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
步驟九：第20天收獲細(xì)胞，收集5瓶細(xì)胞培養(yǎng)物，在室溫下，采用離心機(jī)在1500rpm下，離心10min；
步驟十：計(jì)數(shù)，取少量細(xì)胞，稀釋至200倍，可收獲細(xì)胞數(shù)量約為3-4×109個(gè)；
步驟十一：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+細(xì)胞比例，此類(lèi)細(xì)胞為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，利用無(wú)血清凍存液凍存該細(xì)胞于液氮中。
主要參考資料
[1] CN201811454732.2 一種體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法