背景及概述[1]
DNA連接酶在DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)過(guò)程中扮演重要角色。它以ATP或NAD+作為輔酶來(lái)催化2個(gè)DNA鏈之間的3’-羥基（3’-OH）和5’-磷酸（5’-P）形成磷酸二酯鍵。這2類(lèi)連接酶的反應(yīng)機(jī)理相近：（1）NAD+或ATP將其腺苷?；D(zhuǎn)移到DNA連酶賴(lài)氨酸殘基的ε-氨基上，形成酶-腺苷酸共價(jià)復(fù)合物中間體，同時(shí)釋放出煙酰胺單核苷酸或焦磷酸；（2）然后，酶-腺苷酸共價(jià)復(fù)合物上的腺苷?；D(zhuǎn)移到DNA鏈的5’-P，形成被激活的焦磷酸鍵；（3）最后，相鄰鏈的3’-OH與被激活的5’-P結(jié)合在2條鏈之間形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出一磷酸腺苷（AMP）。常用的DNA連接酶有Ｅ．ｃｏｌｉDNA連接酶、T4DNA連接酶和TaqDNA連接酶等。T4DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，是ATP依賴(lài)的DNA連接酶，可連接雙鏈DNA的黏性末端和平末端。但它只能在低于37℃的溫度下使用，且對(duì)于堿基錯(cuò)配不敏感。Taq DNA連接酶熱穩(wěn)定性高，是NAD+依賴(lài)的連接酶，在45～65℃均有很強(qiáng)的活性。隨著生物技術(shù)的深入發(fā)展，連接酶的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。例如，T4DNA連接酶在基因工程中常被用于將目的片段與載體連接，構(gòu)建新的表達(dá)載體；它也可用于連接酶介導(dǎo)的PCR等基因檢測(cè)技術(shù)。但是由于T4DNA連接酶錯(cuò)配區(qū)分能力較差，連接特異性低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。而熱穩(wěn)定的TaqDNA連接酶，區(qū)別錯(cuò)配的能力明顯高于T4DNA連接酶，因此Taq DNA連接酶可更好地應(yīng)用于檢測(cè)技術(shù)。T4DNA連接酶發(fā)現(xiàn)較早，其連接特性已得到了較深入研究，但一般認(rèn)為T(mén)aqDNA連接酶只能連接較長(zhǎng)的黏性末端或切口部位，對(duì)其連接特性，尤其是短鏈的連接還很少有報(bào)道，因此本研究對(duì)其連接特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，可為開(kāi)發(fā)與DNA連接酶相關(guān)的生物技術(shù)提供依據(jù)。由于Taq DNA連接酶的連接溫度較高（65℃），一般需要足夠長(zhǎng)的DNA雙鏈（＞22nt）來(lái)確保該雙鏈在連接溫度下不發(fā)生解鏈，很難研究更高溫度（如70℃）的連接特性。另外，使用雙鏈底物時(shí)很難保證連接的寡核苷酸片段以1∶1的比例加入。有些短的發(fā)卡結(jié)構(gòu)在高溫下很穩(wěn)定，如環(huán)區(qū)序列為ＧＮＡ或ＧＮＮＡ的發(fā)卡結(jié)構(gòu)都非常穩(wěn)定。而且發(fā)卡結(jié)構(gòu)在分子內(nèi)形成，一條鏈即可形成連接所需的黏性末端結(jié)構(gòu)，而且莖部只有5～6個(gè)堿基（GC含量較高）時(shí)，其Tm值就可達(dá)到80℃。
鏈接特性[1]
為進(jìn)一步研究TaqDNA連接酶的作用機(jī)理、開(kāi)發(fā)以DNA連接作為關(guān)鍵步驟的新生物技術(shù)，本文以含有超穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA（帶有11nt長(zhǎng)的單鏈部分）和另一條單鏈DNA為連接底物，研究了片段長(zhǎng)度、反應(yīng)溫度、連接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特性、聚乙二醇（PEG）的添加等對(duì)連接的影響，探討了Taq DNA連接酶的連接特性。連接結(jié)果顯示：?jiǎn)捂淒NA的3’端同發(fā)卡結(jié)構(gòu)I底物相連的連接率，比單鏈DNA的5’端同發(fā)卡結(jié)構(gòu)II底物相連的連接率更高；可以連接的最短單鏈DNA片段的長(zhǎng)度為6nt；在20～65℃范圍內(nèi)，一般連接率隨溫度升高而升高。在連接時(shí)，由2條底物通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)形成的復(fù)合體的熱穩(wěn)定性對(duì)連接率影響不大，一般在連接溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該復(fù)合體的熔點(diǎn)時(shí)仍有很高的連接率。在70或75℃時(shí)，雖然連接率有所降低，但仍然可以連接9nt的單鏈DNA片段。研究還發(fā)現(xiàn)，在片段連接上，PEG6000對(duì)較難連接的片段有促進(jìn)作用，對(duì)容易連接的片段（8～10nt）促進(jìn)作用不顯著，甚至有一定抑制作用。
相關(guān)研究[2]
構(gòu)建了新型納米金比色芯片，利用TaqDNA連接酶的連接特異性，將其與乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)靶序列完全互補(bǔ)雜交的捕獲探針(固定在芯片上)和納米金修飾的探針連接成一條鏈，從而將納米金顆粒固定到芯片點(diǎn)陣上，再通過(guò)銀染反應(yīng)放大，形成裸眼可見(jiàn)的顯色信息。通過(guò)點(diǎn)陣的位置及灰度，即可判斷HBV-DNA靶序列的單堿基突變，并得出相對(duì)定量信息。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度的HBV-DNA靶序列進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示：此技術(shù)對(duì)單堿基突變有很強(qiáng)的特異性識(shí)別能力，并且具有較高的靈敏度(約10pmol/L)，在10～100pmol/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的線(xiàn)性關(guān)系。該技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短(1h)、操作簡(jiǎn)單、不需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
主要參考資料
[1] Ｔｈｅｒｍｕｓ?。幔瘢酰幔簦椋悖酰蟆NA連接酶的連接特性研究
[2] 高靈敏納米金比色芯片檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA及其變異