背景^[1-6]

親和力成熟是指機體正常存在的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中，再次應(yīng)答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應(yīng)答。這種現(xiàn)象稱為抗體親和力成熟。親和力是抗體藥物的一個關(guān)鍵參數(shù)，通常會影響抗體的功能和藥效。一般而言，采用雜交瘤細胞技術(shù)生成的抗體或者人源化抗體已經(jīng)具有相對較高的親和力，但是這種親和力可能并不足以滿足治療性抗體的需要。目前，藥用抗體的研發(fā)主要基于雜交瘤細胞或者體外抗體庫。

通過抗原設(shè)計和抗體篩選，人們初步獲得陽性的hits，再進一步通過一系列生物性質(zhì)檢測和功能驗證，最終得到有藥用潛力的抗體。在實際研發(fā)過程中，經(jīng)過了常規(guī)篩選所得的抗體，有諸多方面需要更細致的改進，包括親和力、免疫原性、半衰期等等，抗體領(lǐng)域這些年來做了很多相關(guān)的研究和實踐。其中，抗體親和力成熟是研究的重要方向之一。

理論上，抗體親和力的提高有助于改善抗體的特異性和效力，有助于減少用藥劑量，降低毒副作用等。雖然實際的研究工作證明親和力的提高與抗體效價的提高并不總是線性的關(guān)系，尤其在實體瘤的治療上，但很多情況下，這個線性關(guān)系是明顯存在的。另外，發(fā)展抗體親和力成熟的技術(shù)，不僅有助于抗體藥物的研發(fā)和質(zhì)量改善，同時也有助于人們更好地理解抗體與靶點相互作用的機理，更好地認識靶點的功能。

以基于抗體庫的親和力成熟策略為例：

基于抗體庫的抗體親和力成熟與基于抗體庫的抗體篩選并無本質(zhì)差別，均為體外高親和力抗體篩選，重點仍是兩個方面，即庫的構(gòu)建和篩選系統(tǒng)的選擇。區(qū)別在于，后者所用的庫在構(gòu)建或合成時無偏向性或只具有針對某抗原的有限的偏向性；而前者所用的庫是基于確定的抗體序列模板所構(gòu)建的。

1. 建庫策略不同

建庫的策略可分為兩個大的類別：一類是構(gòu)建較大的庫，將抗體CDR區(qū)域甚至整個V區(qū)做隨機突變；另一類是構(gòu)建較小的庫，將突變集中于抗體序列上特定的區(qū)域。構(gòu)建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段隨機突變并保證相鄰兩個突變區(qū)域有所重疊，從而使突變覆蓋整個CDR區(qū)域；chain shuffling是將抗體的VH和VL的配對重新洗牌，而DNA shuffling則是將抗體V區(qū)的序列重新洗牌。在DNA shuffling中，突變不限于CDR區(qū)，也包括FR區(qū)域，因為FR區(qū)域?qū)τ诳贵w與抗原的結(jié)合也可能有所貢獻。

2.篩選方法

基于庫的抗體親和力成熟與基于庫的抗體初步篩選涉及的方法基本相同，主要是利用噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示等系統(tǒng)。噬菌體展示的優(yōu)勢在于操作方便，流程相對簡易；酵母展示的優(yōu)勢在于與流式分選相結(jié)合，檢測和篩選同時進行；核糖體展示的優(yōu)勢是系統(tǒng)容量較大，可用于大庫的篩選，另外可以實現(xiàn)庫的體外進化。

應(yīng)用^[7][8]

親和力成熟技術(shù)可用于高效抗體藥物的開發(fā)：

在可內(nèi)化的人源抗Met基因工程抗體Fab的親和力成熟與特性分析的研究中就使用噬菌體展示技術(shù)制備抗Met(HGF受體,一個與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)原癌基因產(chǎn)物)特異性、高親和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以從錯配PCR突變庫中篩選出的Fab基因可變區(qū)為模板,擴增VH和VL基因,分別與CH1、CL基因融合,合成Fd和L基因,再拼接合成Fab基因,克隆于pComb3XSS中,構(gòu)建Fab次級抗體庫.經(jīng)細胞篩選和固相篩選,獲得高親和力陽性克隆。

工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析,在25ku和27ku出現(xiàn)預(yù)期大小蛋白質(zhì)條帶.Fab分子經(jīng)流式細胞術(shù)、免疫沉淀、細胞免疫熒光檢測,結(jié)果表明,Fab能夠與S114和MKN45細胞膜上的Met胞外區(qū)特異性結(jié)合,而與陰性細胞NIH3T3不結(jié)合.抗體內(nèi)化分析顯示,Fab能夠與標(biāo)記肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG結(jié)合,并進入細胞內(nèi),抑制Met陽性細胞的生長,揭示該抗體能夠與Met特異性結(jié)合,并且被細胞內(nèi)化.該抗體有望成為腫瘤臨床診斷或治療的候選分子.

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