背景[1-7]
ChIRP（Chromatin Isolation by RNA Purification）試劑盒運用于研究RNA與DNA、RNA及蛋白質之間相互作用的實驗。根據(jù)研究對象不同，ChIRP技術結合了高通量測序（ChIRP-Seq）和質譜技術（ChIRP-MS）分別研究與目標RNA互作的基因和蛋白質。ChIRP技術是通過設計生物素探針組，通過堿基互補配對將目標RNA特異性拉下的同時會富集與其互作的DNA、RNA或蛋白質（RBPs），最后將基因開展高通量測序或PCR，可以得到該調控RNA轉錄調控的下游靶基因。
與此同時，RBPs可以開展Western Blot驗證或者MS鑒定。ChIRP是研究體內RNA與蛋白互作的有力工具。該技術在特定時間點用甲醛交聯(lián)等方式固定細胞內RNA與蛋白及核酸的互作復合物，再利用生物素標記的探針及鏈霉親和素磁珠純化出靶RNA及其與它結合的蛋白、核酸復合物，復合物中的蛋白質被洗脫下來western-blot，可以驗證某個蛋白是否與靶RNA結合；洗脫下來的蛋白液做質譜鑒定，即可篩選出與目的RNA結合的蛋白。
技術原理：生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用；其中活化生物素可以在蛋白質交聯(lián)劑的介導下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯(lián)。ChIRP技術利用生物素標記探針識別靶RNA，在純化靶RNA的同時將與它結合的蛋白也一并純化出來，洗脫得到靶RNA的結合蛋白質。
實驗流程：
1.ChIRP探針設計合成
2.lncRNA復合物交聯(lián)
3.超聲打斷
4.探針雜交
5.DNA回收純化
6.測序分析
ChIRP試劑盒優(yōu)勢：
1.研究與LncRNA或其他染色質相關RNA相互作用的蛋白或DNA。
2.有效的檢測與染色質相關的RNA在基因組上的作用位點。
3.高特異性：利用evenodd捕獲探針消除非特異信號確保清晰的檢測到特異性相互作用。
4.高靈敏性：利用PureProteomeTM Streptavid in6磁珠進行pull down。
5.操作簡單方便：試劑盒提供了實驗所需要的緩沖液，和試劑。
6.試劑盒中提供陰陽性對照，確保實驗順利進行，實驗結果準確。
7.實驗獲得的染色質可用RT-qPCR,qPCR和二代測序等方法進行檢測。
8.實驗可獲取內源性的lncRNA與染色質的天然復合物，結果更加真實可信。
應用[8]
ChIRP試劑盒可用于RNA結合蛋白在體內條件下的驗證和篩選。
例如在多能干細胞關鍵因子Oct4 RNA結合蛋白的分離與鑒定中先經(jīng)高效液相色譜-質譜法鑒定和篩選出121個能與Oct4 3’非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)和Oct45’UTR相結合的RNA結合蛋白,肽段圖譜匹配數(shù)≥2的有11個。再培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞(R1),從中提取細胞總RNA,反轉錄為cDNA,PCR擴增Oct4并轉錄為m RNA。采用鏈霉素親和層析和質譜技術篩選候選RNA結合蛋白,采用ChIRP劑盒鑒定候選RNA結合蛋白。
參考文獻
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[3] Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.Cell 161(2):404-416(2015).
[4] Translationally controlled tumor protein interacts with nucleophosmin during mitosis in ES cells[J].Helena Johansson,Dzeneta Vizlin-Hodzic,Tomas Simonsson,Stina Simonsson.Cell Cycle.2010(11)
[5] Role of Npm1 in proliferation,apoptosis and differentiation of neural stem cells[J].Yang Qing,Gao Yingmao,Bing Lujun,Li shaoling.Journal of the Neurological Sciences.2007(1)
[6] Inducible and reversible suppression of Npm1 gene expression using stably integrated small interfering RNA vector in mouse embryonic stem cells[J].Bei Bei Wang,Rui Lu,Wei Cheng Wang,Ying Jin.Biochemical and Biophysical Research Communications.2006(4)
[7] Induction of Pluripotency in Mouse Somatic Cells with Lineage Specifiers[J].Jian Shu,Chen Wu,Yetao Wu,Zhiyuan Li,Sida Shao,Wenhui Zhao,Xing Tang,Huan Yang,Lijun Shen,Xiaohan Zuo,Weifeng Yang,Yan Shi,Xiaochun Chi,Hongquan Zhang,Ge Gao,Youmin Shu,Kehu Yuan,Weiwu He,Chao Tang,Yang Zhao,Hongkui Deng.Cell.2015(5)
[8] 馬姬,郭傳亮,范書玥,薛燕,曾凡一.多能干細胞關鍵因子Oct4 RNA結合蛋白的分離與鑒定[J].上海交通大學學報(醫(yī)學版),2019,39(01):4-10.