背景[1-3]
人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞源自一位28歲男性腺樣囊性癌患者，人腭部小涎腺腺樣囊性癌組織小塊靜置培養(yǎng)7天細(xì)胞開始生長，首次傳代50天，BALB/C,CBA,Swiss，DF裸小鼠皮下移植成瘤，表達角蛋白。STR檢測發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞被HeLa細(xì)胞污染。
人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞
人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞培養(yǎng)操作:
1)復(fù)蘇人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
3)人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細(xì)胞計數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞可以用于沉默UBE3A基因表達對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
UBE3A在SACC中的表達顯著高于正常的涎腺組織,因此UBE3A能否成為SACC基因治療的潛在靶點值得進一步探究。
目的:(1)通過對比UBE3A沉默前后SACC-LM細(xì)胞侵襲及遷移能力的改變,探索UBE3A對SACC細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。
(2) 通過對比UBE3A沉默前后SACC-LM細(xì)胞增殖和凋亡結(jié)果的差異,探究UBE3A是否參與SACC細(xì)胞的增殖和凋亡過程。
(3) 通過檢測并對比UBE3A沉默前后SACC-LM細(xì)胞中VEGF和抑癌基因p53、PTEN蛋白表達水平的改變,探究UBE3A影響SACC生物學(xué)行為的可能機制,為研究泛素化在SACC中的功能及其機制奠定基礎(chǔ)。
方法:構(gòu)建沉默UBE3A表達的重組慢病毒并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SACC-LM細(xì)胞中,采用實時熒光定量PCR(Real-time quantative PCR,RT-q PCR)檢測細(xì)胞m RNA中UBE3A表達水平,篩選沉默效率最高的組別設(shè)置為后續(xù)研究的實驗組,同時采用蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)進一步驗證其沉默效果。利用Transwell小室法、細(xì)胞劃痕愈合實驗、CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)等方法分別檢測細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖和凋亡情況,同時通過WB實驗技術(shù)了解細(xì)胞中VEGF、p53及PTEN蛋白的表達情況,最后根據(jù)實驗結(jié)果對比分析,揭示沉默UBE3A表達對SACC生物學(xué)行為影響的作用機制,為UBE3A成為SACC的有效治療靶點提供理論依據(jù)。
結(jié)果:Transwell小室法、細(xì)胞劃痕愈合實驗及CCK-8法的實驗結(jié)果分別表明沉默UBE3A的表達可抑制SACC細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示沉默UBE3A的表達后SACC細(xì)胞的凋亡增多;WB實驗結(jié)果表明UBE3A的表達下調(diào)后p53及PTEN蛋白的表達水平將上調(diào),VEGF的表達受到了抑制。
結(jié)論:UBE3A在涎腺組織中的過表達可能參與了SACC的發(fā)生,從而在腫瘤的發(fā)展過程中促進了腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖及抗凋亡能力,因此通過抑制UBE3A的表達阻止SACC的發(fā)生及發(fā)展可能是潛在的治療方法之一。
參考文獻
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[2]CASC9 plays a role in salivary adenoid cystic carcinoma in vitro by upregulation of ACLY..Xie Hongliang;Tang Jianming;Lu Lu;Li Bohan;Wang Mengmeng.Oral diseases,2020
[3]Fatty acid synthase contributes to epithelial-mesenchymal transition and invasion of salivary adenoid cystic carcinoma through PRRX1/Wnt/β-catenin pathway..Zhang Wei Long;Wang Sha Sha;Jiang Ya Ping;Liu Yan;Yu Xiang Hua;Wu Jing Biao;Wang Ke;Pang Xin;Liao Peng;Liang Xin Hua;Tang Ya Ling.Journal of cellular and molecular medicine,2020
[4]Expression of inhibitors of apoptosis proteins in salivary gland adenoid cystic carcinoma:XIAP is an independent marker of impaired cause-specific survival..Schnoell Julia;;Kadletz Lorenz;;Jank Bernhard J;;Oberndorfer Felicitas;;Brkic Faris F;;Gurnhofer Elisabeth;;Cede Julia;;Seemann Rudolf;;Kenner Lukas;;Heiduschka Gregor.Clinical otolaryngology:official journal of ENT-UK;official journal of Netherlands Society for Oto-Rhino-Laryngology&Cervico-Facial Surgery,2020
[5]羅建峰.沉默UBE3A基因表達對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D].電子科技大學(xué),2022.