背景[1-3]
人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分離自低分化胚胎性神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的骨髓轉(zhuǎn)移。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是由身體多個(gè)部位的未成熟神經(jīng)細(xì)胞發(fā)展而來(lái)的一種惡性腫瘤。發(fā)病率并不高，但是嬰兒最常見(jiàn)的腫瘤，也常見(jiàn)于兒童。神經(jīng)母細(xì)胞瘤始于成神經(jīng)細(xì)胞，大多數(shù)情況下，成神經(jīng)細(xì)胞會(huì)隨著嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)的成熟而發(fā)育為神經(jīng)細(xì)胞。
但是在患病的嬰兒中，突變的成神經(jīng)細(xì)胞無(wú)法正常成熟，而是不斷生長(zhǎng)分裂，最終導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的體征和癥狀因起源部位的不同，而呈現(xiàn)不同。常見(jiàn)的癥狀包括有腹脹、腹痛、便秘或腹瀉、嘔吐、厭食、體重減輕、呼吸困難、疲勞和骨痛等。
人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞
人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作:
1)復(fù)蘇人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書為主。
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞可以用于circHIPK3調(diào)控miR-653-5p/RSF1軸對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma,NB)是小兒常見(jiàn)的一種惡性實(shí)體腫瘤,號(hào)稱“兒童惡性腫瘤之王”,難治和復(fù)發(fā)依舊是治療NB時(shí)的挑戰(zhàn)。環(huán)狀同源域相互作用蛋白激酶3(circular homeodomain interacting protein kinase 3,circHIPK3)在許多腫瘤的進(jìn)展中都起到了關(guān)鍵的作用,但其在NB中的作用尚不明確。
本研究意在探討circHIPK3在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制。研究方法通過(guò)二代測(cè)序法篩選出NB組織中具有表達(dá)差異的環(huán)狀RNA;使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-q PCR)驗(yàn)證circHIPK3、miR-653-5p和RSF1在NB組織與人NB細(xì)胞系SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-N-BE(2),IMR-32和人胚腎細(xì)胞系HEK-293中的表達(dá);分別向NB細(xì)胞系SH-SY5Y和SK-N-SH中轉(zhuǎn)染小干擾RNA si-NC和si-circHIPK3或慢病毒敲降載體sh-NC和sh-circHIPK3;使用CCK-8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circHIPK3在NB細(xì)胞系SH-SY5Y、SK-N-SH增殖中的作用;使用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circHIPK3對(duì)NB細(xì)胞系SH-SY5Y、SK-N-SH遷移和侵襲的能力變化;使用Western blot檢測(cè)NB細(xì)胞系SH-SY5Y、SK-N-SH中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá);通過(guò)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)探討circHIPK3在體內(nèi)對(duì)NB的影響;生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)circHIPK3的下游調(diào)控靶標(biāo),并用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證二者之間的靶向調(diào)控關(guān)系;向穩(wěn)定敲低circHIPK3的NB細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-653-5p抑制物,利用CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)等方法探究miR-653-5p與NB細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的聯(lián)系。
結(jié)果:CircHIPK3和RSF1在NB細(xì)胞和組織中高表達(dá),miR-653-5p在NB細(xì)胞和組織中低表達(dá)。分別向SH-SY5Y細(xì)胞和SK-N-SH細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-circHIPK3后,細(xì)胞中circHIPK3的表達(dá)量下降。CCK-8、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證實(shí),隨著circHIPK3的逐步敲低,NB細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲能力都有所下降;Western blot結(jié)果表明在抑制circHIPK3表達(dá)時(shí),N-鈣黏蛋白和波狀蛋白的表達(dá)減少,E-鈣黏蛋白表達(dá)反而增加。
裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲低circHIPK3的表達(dá)可以抑制NB在體內(nèi)的生長(zhǎng)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)證明了在circHIPK3與miR-653-5p之間、miR-653-5p與RSF1(Remodeling and Spacing Factor1)之間有靶向調(diào)控位點(diǎn)。細(xì)胞功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)circHIPK3通過(guò)調(diào)控miR-653-5p/RSF1軸從而影響NB細(xì)胞的惡性表型。結(jié)論circHIPK3在NB細(xì)胞和組織中高度表達(dá),沉默了circHIPK3的表達(dá)能夠抑制NB細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力和EMT,同時(shí)也抑制NB細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng);進(jìn)一步研究表明,circHIPK3通過(guò)調(diào)節(jié)miR-653-5p/RSF1軸影響NB細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲。
意義：敲低circHIPK3的表達(dá)能夠抑制NB細(xì)胞的惡性表型及NB細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng),所以circHIPK3可能是治療NB藥物的一個(gè)新的切入點(diǎn),給抗NB藥物的研發(fā)提供一個(gè)全新的思路。
參考文獻(xiàn)
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[2]Circular RNA_ANKIB1 accelerates chemo-resistance of osteosarcoma via binding microRNA-26b-5p and modulating enhancer of zeste homolog 2..Tang JinShan;Duan Gang;Wang YunQing;Wang Bin;Li WenBo;Zhu ZiQiang.Bioengineered,2022
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[5]尉嘉斌.circHIPK3調(diào)控miR-653-5p/RSF1軸對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響[D].青島大學(xué),2022.