背景^[1-6]

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng),利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體,可以使很多真核目的基因得到有效甚至高水平表達(dá).由于hBM P3的活性形式是二聚體,中間有7個(gè)保守半胱氨酸。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(baculovirus expression vector system,BEVS)以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體,昆蟲和昆蟲細(xì)胞為受體的表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯和翻譯后蛋白修飾的模式與能力相似，包括糖基化、磷酸化、?；?、信號(hào)肽切除及肽段的切割和分解等，得到的重組蛋白抗原性、免疫原性和功能等生物活性與天然蛋白相似；能容納大分子的插入片段；容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)也是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng),它具有與大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工及轉(zhuǎn)運(yùn)外源蛋白的能力。

目前常用于表達(dá)載體構(gòu)建的桿狀病毒為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa ca lifornica nucleopolyhedro-virus,)AcNPV,家蠶核型多角體病毒(Bmbyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV),及粉紋夜蛾核型多角體病毒(Trichoplusiani nucleopolyhedrovirus,TnNPV)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的宿主細(xì)胞多用草貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、Sf12以及商品化的High FiveTM(Trichoplusia ni,Tn-5B1-4)。昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)的一個(gè)重要特性就是它能提供類似于真核生物的翻譯后修飾過(guò)程。然而,鱗翅目類昆蟲的糖基化途徑與高等真核生物不同,一般生成高苷露糖(Man9-5 GlcNAc2)或寡甘露糖型(Man3-2GlcNAc2)糖蛋白,糖鏈末端極少帶有半乳糖、唾液酸殘基。

應(yīng)用^[7][8]

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可用于真核目蛋白的表達(dá)。

1.在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)人骨形成蛋白3

方法:將h BMP3全長(zhǎng)c DNA克隆入轉(zhuǎn)移載體Bac PK8中,酶切鑒定后,將此載體與病毒DNA經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞,重組病毒經(jīng)藍(lán)白篩選后,提取其DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),鑒定目的基因.收集重組病毒感染5 d的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光及電子顯微鏡觀察.結(jié)果克隆了目的基因的重組載體經(jīng)內(nèi)切酶消化后,瓊脂糖電泳示有相應(yīng)大小的目的基因片段切下.PCR電泳結(jié)果見有目的基因片段的擴(kuò)增.免疫熒光檢測(cè)見陽(yáng)性顆粒分布在昆蟲細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜,電鏡下見重組病毒無(wú)多角體顆粒,與野生型桿狀病毒完全不同。

2. 表達(dá)需要N-糖基化修飾的相關(guān)蛋白

對(duì)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的重組人血纖維蛋白溶酶原的結(jié)構(gòu)分析最早提供了昆蟲細(xì)胞具有產(chǎn)生復(fù)雜的末端唾液酸化的糖蛋白的能力。研究結(jié)果表明,Tn(Trichoplusia ni)細(xì)胞在含有N-乙酰甘露糖胺(唾液酸前體)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生唾液酸化的糖蛋白。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入昆蟲細(xì)胞B-N乙酰葡萄糖胺酶抑制劑,也同樣能得到唾液酸化的糖蛋白。

這些研究表明昆蟲表達(dá)體系是具備一定的復(fù)雜化糖基處理能力的,也為研究者們進(jìn)一步改造其糖基化過(guò)程提供了前提條件。大量的研究表明昆蟲細(xì)胞具有糖基化修飾過(guò)程所必需的A-甘露糖苷酶Ñ、Ò;B-1,2N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ñ、A-1,6-果糖轉(zhuǎn)移酶、同時(shí)胞內(nèi)有高活性的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,但是昆蟲細(xì)胞缺乏B-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性。

而上述兩種酶決定了能否形成復(fù)雜的帶有唾液酸或半乳糖型糖鏈。這說(shuō)明昆蟲細(xì)胞含有N-多糖裁剪類型的酶,卻缺乏N-多糖延長(zhǎng)類型的酶。BEVS生產(chǎn)的糖蛋白具有高甘露糖或A-1,6-果糖化的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)。

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