背景^[1-3]

細胞線粒體分離試劑盒是快速便捷分離培養(yǎng)細胞中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，可用于分析細胞色素C等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如梱測線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。本試劑盒提供臺盼藍染色液和PMSF，可以分別判斷線粒體質(zhì)量和提取細胞漿蛋白。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

細胞線粒體分離試劑盒

細胞線粒體分離試劑盒操作步驟：

1.清洗：用預(yù)冷的PBS清洗細胞1次，4℃1000g離心5min，其上清。

2.裂解：沉淀用1～2ml預(yù)冷的Mitochondria Lysis buffer重懸細胞，冰浴放置10～15min，可用相差顯微鏡梱測膨脹的程度。

3.勻漿：把細胞懸液轉(zhuǎn)移至Dounce勻漿器中，勻漿10～20次。不同細胞或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。

4.臺盼藍染色(可選)：取約2～5μl細胞勻漿液，加入30～50μl Trypan Blue Stain，混勻，顯微鏡觀察臺盼藍染色陽性(藍色)細胞的比例，如果陽性細胞比例不足50%，增加5次勻漿，隨后再同前取樣進行臺盼藍染色鑒定，當(dāng)陽性比例超過50%時即可停止勻漿進入下一步，但勿過度勻漿，否則易導(dǎo)致線粒體的機械損傷。同時記錄對于該細胞的勻漿次數(shù)，在后續(xù)實驗時不必再摸索勻漿次數(shù)。

5.立即取勻漿液，加入等量Wash buffer，輕輕顛倒混勻數(shù)次。

6.4℃，1300g離心5min以去除細胞核、未破碎的細胞和大的膜碎片。

7.上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃1000g離心5min，重復(fù)2次。

8.上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃12000～15000g離心15min，重復(fù)1次。

9.棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，應(yīng)在本步驟中收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12000g，4℃離心10min，上清即為去除線粒體的細胞漿蛋白。

10.保存：棄上清，用適當(dāng)緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應(yīng)重懸于Mitochondria Stock buffer；如果用于線粒體蛋白的分析，獲得的細胞漿蛋白應(yīng)保存于1×Protein Stock buffer，即按細胞漿蛋白：Protein Stock buffer(5×)=1:4比例混合；如果用于雙向電泳，應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)谋４嬉骸?/p>

應(yīng)用^[4][5]

細胞線粒體分離試劑盒可以用于鉬鎘聯(lián)合誘導(dǎo)綿羊肝細胞線粒體質(zhì)量控制失調(diào)的作用機制

從體內(nèi)和體外兩個角度探討線粒體質(zhì)量控制在鉬鎘聯(lián)合致綿羊肝細胞線粒體損傷中的作用,體內(nèi)實驗以鉬酸銨和氯化鎘作為實驗毒源,選擇2月齡綿羊48只,隨機分為4組,每組12只:對照組(生理鹽水,Control組),鉬組(45 mg/kg·BW,Mo組),鎘組(1 mg/kg·BW,Cd組),鉬鎘聯(lián)合組(45 mg/kg·BW Mo+1 mg/kg·BW Cd,Mo+Cd組),在不同處理下飼養(yǎng)50 d,分別在第25 d和第50d取肝臟組織進行相關(guān)實驗。

體外實驗用改良的兩步膠原酶灌注法提取綿羊原代肝細胞并分別建立鉬、鎘及其聯(lián)合毒理模型:對照組(Control組),鉬組(600μM Mo),鎘組(4μM Cd),鉬鎘聯(lián)合組(600μM Mo+4μM Cd),以及線粒體抑制劑(Cs A,1μM)和VDAC1抑制劑(VBIT,100μM),處理24 h。利用病理組織學(xué)觀察、透射電鏡、免疫熒光、Clark氧電極、流式細胞術(shù)、RT-q PCR、Western blot和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法,對病理形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、MDA、GSH-Px、CAT)、ROS水平、線粒體膜電位水平(MMP)、線粒體呼吸功能指標(biāo)(RCR、OPR)、線粒體動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)(Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、Mfn2)、線粒體自噬相關(guān)指標(biāo)(LC3A、LC3B、P62、Parkin、Pink1、VDAC1)和線粒體生物發(fā)生相關(guān)指標(biāo)(mt DNA、PGC-1α)等進行檢測。

結(jié)果表明:(1)體重、肝功能和金屬離子檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,鉬、鎘及其聯(lián)合脅迫下綿羊體重下降且肝指數(shù)升高;血清ALT、AST水平升高,而TC、TG、HDLC、LDL-C水平下降;肝臟中Mo、Cd、Cu、Zn含量顯著升高,揭示Mo、Cd毒性作用下影響綿羊肝功能及肝臟組織中的金屬離子穩(wěn)態(tài)。

(2) 病理組織學(xué)結(jié)果顯示,處理組肝細胞間隙增大,細胞核皺縮,肝竇、肝鎖及肝小葉明顯擴張,排列紊亂,肝細胞發(fā)生空泡變性;透射電鏡顯示處理組肝臟及肝細胞線粒體嵴斷裂、缺失,線粒體腫脹且空泡化嚴(yán)重,線粒體自噬體增多。

(3) 蛋白組學(xué)結(jié)果顯示,鉬鎘聯(lián)合脅迫下線粒體共鑒定出360個差異蛋白,其中213個上調(diào)蛋白,147個下調(diào)蛋白;GO注釋和KEGG通路分析,差異蛋白主要與細胞色素P450對外源性物質(zhì)的代謝、溶酶體、吞噬體等信號傳導(dǎo)通路有關(guān),進一步說明鉬鎘聯(lián)合誘導(dǎo)了肝線粒體蛋白表達差異,從而造成線粒體損傷。

(4) 鉬、鎘及其聯(lián)合導(dǎo)致綿羊肝細胞線粒體抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性下降,ROS水平及MDA含量升高;Cs A處理后加重了肝細胞線粒體氧化應(yīng)激水平,而VBIT處理后緩解了肝細胞線粒體氧化應(yīng)激水平。

(5) 鉬、鎘及其聯(lián)合導(dǎo)致綿羊肝細胞MMP、RCR、OPR水平和ATP含量降低,表明其引起綿羊肝細胞線粒體功能障礙;Cs A處理后加劇了鉬鎘聯(lián)合引起的線粒體功能障礙,而VBIT處理后緩解了線粒體功能障礙。

(6) 鉬、鎘及其聯(lián)合引起綿羊肝臟和肝細胞Drp1、Fis1 m RNA和蛋白表達水平升高,OPA1、Mfn1、Mfn2 m RNA和OPA1、Mfn2蛋白表達水平降低;mt DNA拷貝數(shù)增多,PGC-1αm RNA和蛋白表達下調(diào),表明鉬、鎘及其聯(lián)合增加線粒體分裂,減少線粒體融合,破壞線粒體動力學(xué)平衡并抑制線粒體生物發(fā)生。Cs A處理后加劇了上述結(jié)果變化,而VBIT處理則緩解了上述結(jié)果變化。

(7)鉬、鎘及其聯(lián)合增加了綿羊肝臟LC3B熒光共定位水平、肝細胞線粒體與溶酶體共定位水平;綿羊肝臟和肝細胞LC3A、LC3B、Parkin、Pink1、VDAC1m RNA和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Pink1、Parkin、VDAC1蛋白表達水平上調(diào),而P62m RNA和蛋白表達水平下調(diào),表明鉬、鎘及其聯(lián)合增加了線粒體自噬水平。Cs A和VBIT處理均能降低線粒體自噬水平。

參考文獻

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