背景^[1-6]

Puromycin Dihydrochloride(嘌呤霉素)是一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化、病毒感染等方法能表達(dá)pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。

Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。Puromycin的特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。在革蘭氏陽性菌、動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中，嘌呤霉素通過抑制蛋白質(zhì)合成而抑制或殺死細(xì)胞。

其作用機(jī)制為嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的類似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素與A位點(diǎn)結(jié)合后，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

Pac基因表達(dá)嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，該基因是在Streptomyces alboniger中發(fā)現(xiàn)的。如果表達(dá)基因，就會(huì)對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性，這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株等。例如，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達(dá)pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

研究應(yīng)用^[7][8]

1.用于嘌呤霉素致足細(xì)胞損傷細(xì)胞模型的建立

建立小鼠足細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型,為進(jìn)一步從細(xì)胞、分子水平研究足細(xì)胞的生物學(xué)作用,以及足細(xì)胞特別是裂孔隔膜(slit diaphragm)分子在蛋白尿發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制提供穩(wěn)定、可靠的足細(xì)胞損傷模型。

方法:應(yīng)用不同濃度的嘌呤霉素(15mg/L、45mg/L和75mg/L)作用于足細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測作用24h和48h后足細(xì)胞的凋亡情況,以確定嘌呤霉素的作用濃度和時(shí)間,建立足細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型;并以噻唑藍(lán)(MTT)檢測足細(xì)胞損傷后的活力,應(yīng)用免疫熒光染色觀察裂孔隔膜關(guān)鍵分子Nephrin、Podocin以及骨架蛋白F-actin在足細(xì)胞損傷中的分布來評價(jià)足細(xì)胞損傷。

結(jié)果:45mg/L嘌呤霉素作用48h以及75mg/L嘌呤霉素作用24h或48h,足細(xì)胞明顯凋亡。結(jié)論:嘌呤霉素可以呈時(shí)間和劑量依賴性誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡,45mg/L嘌呤霉素作用48h后誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型穩(wěn)定、可靠,可應(yīng)用于足細(xì)胞損傷的研究。

2.用于嘌呤霉素?fù)p傷小鼠腎小球足細(xì)胞系中podocin表達(dá)與分布影響的研究

采用體外培養(yǎng)腎小球足細(xì)胞系,探討足細(xì)胞損傷過程中,podocin mRNA表達(dá)和分布變化與足細(xì)胞損傷的關(guān)系。方法將體外培養(yǎng)的足細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字表法設(shè)立為實(shí)驗(yàn)組與對照組。實(shí)驗(yàn)組采用嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)刺激(劑量為50μg/mL),分別于8 h,24 h和48 h觀察細(xì)胞形態(tài)、提取總RNA和細(xì)胞免疫組化觀察podocin的分布。對照組用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞圖像應(yīng)用Image J圖像處理軟件,計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組在上述各時(shí)間點(diǎn)200倍鏡下隨機(jī)選擇的30個(gè)細(xì)胞的相對面積,半定量RT-PCR和間接免疫熒光法檢測podocin mRNA表達(dá)和分布變化。

結(jié)果對照組呈星形伸出樹枝狀突起,相鄰細(xì)胞間形成相互連接。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體縮小,足突回縮、消失,細(xì)胞間失去相互連接。上述各時(shí)間點(diǎn)兩組間podocin mRNA表達(dá)比較,差異無顯著意義(P>0.05)。Podocin在對照組呈細(xì)絲狀均勻分布于細(xì)胞核膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜;在實(shí)驗(yàn)組主要沿細(xì)胞核膜呈點(diǎn)線樣分布,刺激后8 h和24 h細(xì)胞質(zhì)有少許分布,刺激48 h后出現(xiàn)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)分布缺失。結(jié)論P(yáng)odocin分布異常與足細(xì)胞損傷密切相關(guān),損傷早期即有變化;podocin分布異常是足細(xì)胞損傷過程中的重要分子效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1] Pestka,S.(1971)."Inhibitors of ribosome functions".Annu.Rev.Microbiol.25:487–562.doi:10.1146/annurev.mi.25.100171.002415.PMID 4949424.

[2] Eggers DK,Welch WJ,Hansen WJ(1997)."Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells".Mol Biol Cell.8(8):1559–1573.

[3] Starck SR,Green HM,Alberola-Ila J,Roberts RW(2004)."A general approach to detect protein expression in vivo using fluorescent puromycin conjugates".Chem.Biol.11(7):999–1008.

[4] Dando,Pam M.;Young,Nina E.;Barrett,Alan J.(1997)."Aminopeptidase PS:a Widely Distributed Cytosolic Peptidase".In Hopsu-Havu,VäinöK.;Järvinen,Mikko;Kirschke,Heidrun.Proteolysis in Cell Functions.IOS Press.pp.88–95.ISBN 978-90-5199-322-6.

[5] McDonald JK,Reilly TJ,Zeitman BB,Ellis S(1968)."Dipeptidyl arylamidase II of the pituitary.Properties of lysylalanyl-beta-naphthylamide hydrolysis:inhibition by cations,distribution in tissues,and subcellular localization".The Journal of Biological Chemistry.243(8):2028–37.PMID 5646493.

[6] "Archived copy".Archived from the original on 2014-10-10.Retrieved 2014-05-11.

[7] 嘌呤霉素?fù)p傷小鼠腎小球足細(xì)胞系中podocin表達(dá)與分布的影響及其意義[J].溫躍強(qiáng),于力,溫捷,郝志宏,陳蓉燕,王麗娜.中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志.2008(05)

[8] 嘌呤霉素腎病大鼠腎小球中nephrin、podocin和α-actinin與蛋白尿的關(guān)系[J].管娜,丁潔,張敬京,楊霽云.中華腎臟病雜志.2004(01)