背景^[1]

適體修飾熱啟動(dòng)酶(Hotstart Taq DNA Polymerase)是一種適體基團(tuán)修飾的耐熱性Taq DNA聚合酶,高溫加熱前,適體修飾基團(tuán)與Taq酶結(jié)合,抑制聚合酶的活性,避免了引物延伸的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生,增強(qiáng)了DNA擴(kuò)增的特異性,靈敏度和穩(wěn)定性,廣泛適用于常規(guī)PCR,多重PCR及巢式PCR等。經(jīng)過(guò)95°C熱激10 min后,該酶即可恢復(fù)活性。

適體修飾熱啟動(dòng)酶沒(méi)有檢測(cè)到3′→5′校對(duì)外切酶活性,但具有5′→3′外切酶活性,可用于熒光定量PCR的檢測(cè)。Hotstart Taq DNA Polymerase在常溫下沒(méi)有活性,便于PCR實(shí)驗(yàn)的常溫操作。

提高適體修飾熱啟動(dòng)酶耐熱性^[2]

Stofell片段是 Taq DNA聚合酶通過(guò)缺失突變?nèi)コ齆端第1－289個(gè)氨基酸而得到的。實(shí)驗(yàn)證明，全長(zhǎng) Taq DNA聚合酶在97．5℃加熱9min還可以保持一半以上的活性，而 Stofell 7在97．5℃則可以持續(xù)21min保持一半以上的活性Klentaq也是一種 Taq DNA聚合酶的突變體，它也比 Taq DNA聚合酶具有更高的熱穩(wěn)定性。在應(yīng)用方面，去掉N端5－3外切酶活性以后的大片段 Taq DNA聚合酶的耐熱性提高，變性溫度可達(dá)到98℃，更適合擴(kuò)增GC含量高和二級(jí)結(jié)構(gòu)強(qiáng)的模板，結(jié)合其所具有的3－5外切校正功能，使其具備了擴(kuò)增長(zhǎng)鏈DNA的能力，可以擴(kuò)增35kb以上的模板。除此之外，去除大片段 Taq DNA聚合酶表面的10個(gè)不穩(wěn)定的氨基酸，并且加入兩個(gè)硫水氨基酸后，酶的活性和熱穩(wěn)定性都會(huì)有所提高。

熱啟動(dòng)改造與修飾^[3]

Taq DNA聚合酶在75℃－80℃時(shí)活性最高，但是在溫度較低時(shí)，該聚合酶的活性也依然存在。這就使得在PCR反應(yīng)的初始階段，由于引物的量比模板的量高出很多，在儀器升溫過(guò)程中，很容易出現(xiàn)引物互搭或引物與模板中的一些非靶位點(diǎn)錯(cuò)配的現(xiàn)象，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，形成引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。這些引物二聚體和非特異性產(chǎn)物又可作為引物或模板在以后的PCR循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，使非特異產(chǎn)物不斷擴(kuò)增和累積。如果PCR的循環(huán)數(shù)較多、擴(kuò)增子的GC含量較高以及多重PCR體系，也很容易產(chǎn)生引物二聚體和非特異性產(chǎn)物，既降低了目的產(chǎn)物的擴(kuò)增效率，又影響PCR在檢測(cè)及測(cè)序等方面的應(yīng)用。

方法有：基因突變、化學(xué)修飾、抗體修飾法、核酸適配體修飾。

參考文獻(xiàn)

[1] 適體修飾熱啟動(dòng)酶產(chǎn)品介紹

[2] Taq DNA 聚合酶的結(jié)構(gòu)修飾與表征.郭佳

[3] Poddar S, Sawyer M, Conor J. Effect of inhibitors in clinical specimens on Taq and Tth DNA polymerase-based PCR amplification of A virus .Journal of Medical Microbiology.