概述[1]
Abstart Taq DNA 聚合酶是和 Taq DNA 聚合酶的混合制品。高溫加熱前,抗Taq單克隆抗體與 Taq聚合酶結(jié)合從而抑制聚合酶的活性,達(dá)到抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增作用。當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系被加熱到95°C 2 min時,聚合酶活性因抗Taq單克隆抗體變性而得到恢復(fù),因此無需特殊失活處理,在常規(guī)PCR反應(yīng)條件下即可使用。
基本性質(zhì)與結(jié)構(gòu)[2-3]
聚合酶屬于聚合酶I家族，是一種耐熱的聚合酶。該酶的編碼基因全長有2496個堿基，編碼832個氨基酸酶蛋白的分子量為94KD。酶比活性為200000U/mg。該酶的熱穩(wěn)定性很高，在95℃時酶活性半衰期為1.5h；在70℃的高溫下反應(yīng)2h后，還能保持90%以上的活性；在75-80℃時活性最高，延伸效率約為每秒150 個核苷酸。
Taq DNA聚合酶全酶共分為三個結(jié)構(gòu)域，如圖所示。
Taq DNA聚合酶蛋白多肽鏈N端1-291個氨基酸構(gòu)成一個結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域表達(dá)核酸外切瞎活性，可以水解單鏈或雙鏈DNA分子5’端的單核苷酸，釋放出寡核苷酸。該結(jié)構(gòu)域也是二價金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)。
蛋白質(zhì)肽鏈C端的第424-832個氨基酸構(gòu)成另一個結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域表達(dá)5’-3’聚合酶活性。圖1-2是Taq DNA聚合酶的聚合酶活性區(qū)域與DNA結(jié)合時的晶體結(jié)構(gòu)圖。此結(jié)構(gòu)域被形象的比作人類的右手，可分為手掌區(qū)域、拇指區(qū)域及手指區(qū)域。
其中，手掌區(qū)域是酶的催化位點(diǎn)，可催化磷?；D(zhuǎn)移。引物末端的OH對插入的dNTP的α磷?；M(jìn)行親核攻擊，三羧酸鹽側(cè)鏈結(jié)合的金屬離子（如Mg2+）可促進(jìn)引物末端的去質(zhì)子化，使dNTP的α磷酰基處形成過渡狀態(tài)。在拇指區(qū)域，新合成的dsDNA的小溝與要插入的核苷酸進(jìn)行相互作用，該區(qū)域保守性較低，且有大量的螺旋結(jié)構(gòu)。手指區(qū)域在模板的固定和核苷酸的特異性方面具有重要作用。在進(jìn)行合成反應(yīng)時，引物-模板復(fù)合物首先結(jié)合于酶的拇指區(qū)域。然后，手指區(qū)域與單鏈相互作用，并且接納dDTPs,每接納一個dNTP，手指的指尖部位就位向內(nèi)側(cè)移動，從開放的狀態(tài)轉(zhuǎn)變成閉合的狀態(tài)。之后，dNTP在酶的手掌區(qū)域與引物-模板發(fā)生聚合反應(yīng)。
參考文獻(xiàn)
[1] Abstart抗體修飾熱啟動酶產(chǎn)品介紹
[2]Taq DNA 聚合酶的結(jié)構(gòu)修飾與表征.郭佳
[3]Kreader CA.Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein[J].