背景[1-3]
DEAE-DEXTRAN細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒適用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transient tranfection)，不宜用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，這是因?yàn)镈EAE-dextran在較高濃度作用較長時(shí)間會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性。氯喹的加入可以抑制溶酶體對外源DNA的降解，從而提高轉(zhuǎn)染效率。但對于具體的細(xì)胞、具體的培養(yǎng)條件，如需獲得更加理想的轉(zhuǎn)染效率，須自行摸索上述各種轉(zhuǎn)染方法，找出優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法。CHO、DUKX、BⅡ等細(xì)胞也可以通過甘油、DMSO進(jìn)行熱休克處理以提高轉(zhuǎn)染效率。
外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有很多種，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖(Dextran)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、顯微注射法等。DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法的原理是帶正電荷的DEAE-葡聚糖不帶負(fù)電的核酸的磷酸骨架相互作用，形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過細(xì)胞內(nèi)吞噬作用使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核。
DEAE-DEXTRAN細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒
操作步驟：
1.在轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量對數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中，待細(xì)胞密度達(dá)50～70%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)操作步驟均按6孔板計(jì)算，如果轉(zhuǎn)染器皿不同，請按比例自行調(diào)節(jié)用量。
2.棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，再用TBS-D buffer清洗1次，吸盡殘液。
3.配制轉(zhuǎn)染液:對于6孔板，按照下表依次加入8μl DEAE-Dextran，2μl DNA以及適量的TBS-D，使其總體積為170μl，即為DEAE-Dextran-DNA-TBS-D轉(zhuǎn)染液，用移液器輕輕吹打混勻，但不宜采用離心或Vortex等劇烈方式。
4.轉(zhuǎn)染：把170μl轉(zhuǎn)染液滴加到細(xì)胞表面，輕輕晃動(dòng)6孔板，使其不細(xì)胞表面充分接觸，37℃孵育20～40min，觀察細(xì)胞至皺縮變圓為止。
5.緩慢加入1.7ml細(xì)胞培養(yǎng)液(約DEAE-Dextran-DNA-TBS-D轉(zhuǎn)染液體積的10倍)。
6.加入17μl Chloroquine solution，亦可和上一步驟中1.7ml細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)先混合后一起加入。
7.培養(yǎng)不超過2h或在出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性前，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，通常轉(zhuǎn)染后48～72小時(shí)可以檢測轉(zhuǎn)染效果。
應(yīng)用[4][5]
用于DJ-1基因慢病毒的構(gòu)建及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究
蒙古沙鼠圓窗膜上滴注不同濃度的哇巴因,建立不同程度耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Spiral Ganglion Cells,SGCs）損傷的動(dòng)物模型;通過該動(dòng)物模型鼓階內(nèi)注入DJ-1基因慢病毒,研究耳蝸SGCs受損后,DJ-1基因慢病毒的轉(zhuǎn)染及其保護(hù)作用。方法：①聽力正常的雄性蒙古沙鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組與對照組。對照組沙鼠的右耳圓窗膜上滴注人工外淋巴液0.2ml,實(shí)驗(yàn)組沙鼠分成A、B、C三組并在右耳圓窗膜分別滴注濃度為33μM、66μM、80μM總量為0.2ml的哇巴因建立動(dòng)物模型。
②包裝DJ-1基因慢病毒。
③聽力正常的蒙古沙鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組,對照組沙鼠右耳圓窗膜上滴注人工外淋巴液0.2ml,并于鼓階注入DJ-1基因慢病毒;實(shí)驗(yàn)組沙鼠分成A、B、C三組并于右耳圓窗膜分別滴注濃度為33μM、66μM、80μM總量為0.2ml的哇巴因,每組鼓階注入DJ-1慢病毒。兩周后行Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測DJ-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。在蛋白質(zhì)確切表達(dá)的基礎(chǔ)上觀察DJ-1對于不同程度耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的修復(fù)作用。
結(jié)果：形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):隨著哇巴因濃度的上升,SGCs數(shù)量逐漸下降及細(xì)胞腫脹,胞漿空泡化,胞核固縮或溶解。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測到在正常及不同程度SGCs損傷的動(dòng)物模型中,DJ-1基因慢病毒均有轉(zhuǎn)染,并表達(dá)相關(guān)蛋白;本實(shí)驗(yàn)中不同程度SGCs損傷的動(dòng)物模型中注射DJ-1慢病毒,較對照組SGCs無增加。
結(jié)論：①圓窗膜滴注不同濃度哇巴因可以成功建立不同程度SGCs損傷的動(dòng)物模型。
②通過293T細(xì)胞可以成功包裝DJ-1基因慢病毒。
③以慢病毒為載體包裝的DJ-1基因可以成功轉(zhuǎn)染SGCs,并表達(dá)相應(yīng)蛋白。
④本實(shí)驗(yàn)中不同程度SGCs損傷的動(dòng)物模型中DJ-1蛋白無神經(jīng)保護(hù)作用。
參考文獻(xiàn)
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