背景[1-3]
小鼠血清總補體是分離自小鼠抗凝血血清的免疫補體，主要用于檢測小鼠模型的免疫研究。
補體是一種血清蛋白質(zhì)，存在于人和脊椎動物血清及組織液中，不耐熱，活化后具有酶活性、可介導免疫應答和炎癥反應?？杀豢乖?抗體復合物或微生物所激活，導致病原微生物裂解或被吞噬?？赏ㄟ^三條既獨立又交叉的途徑被激活，即經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑。
脊椎動物血液或新鮮制備的血清中存在的血清蛋白質(zhì)系統(tǒng)，由血漿補體成分、可溶性和膜型補體調(diào)節(jié)蛋白、補體受體等30余種糖蛋白組成，是一個具有精密調(diào)控機制的蛋白質(zhì)反應系統(tǒng)，或多分子系統(tǒng)，包括可溶性蛋白、膜結合性蛋白和補體受體，故稱為補體系統(tǒng)。根據(jù)補體系統(tǒng)各成分的生物學功能，可將其分為補體固有成分、補體調(diào)控成分和補體受體(CR)。
小鼠血清總補體
補體C3（C3）和補體C4（C4）在血清中的含量高于其他補體分子，二者在完成補體系統(tǒng)的多種功能中具有十分重要的作用，實驗室測定對于疾病的診斷、治療和病因探討具有重要作用。C3正常參考值為0.9～1.8 g/L，C3增高常見于各種傳染病、急性炎癥和組織損傷、急性腎炎、肝癌等，類風濕性關節(jié)炎患者正常或略有升高。C3降低常見于：免疫復合物引起的增殖性慢性腎小球腎炎（MPGN）、急性鏈球菌感染后腎小球腎炎（AGN）、狼瘡性腎炎、反復性感染、皮疹、肝炎、肝硬化等嚴重肝臟疾患和關節(jié)疼痛等。C4正常參考值為0.1～0.4 g/L，C4增高常見于各種傳染病、急性腎炎、組織損傷、多發(fā)性骨髓瘤等。C4降低常見于免疫復合物引起的腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒性感染、狼瘡性癥候群、肝硬化、肝炎等。
應用[4][5]
用于東方田鼠補體C3和C5分子鑒定及C3靶向重組腺相關病毒構建研究
通過RACE及巢式PCR克隆了東方田鼠補體C3和C5完整基因序列。克隆的東方田鼠C3基因ORF含4988bp,編碼1662個氨基酸。C3蛋白N端具有一個24個氨基酸組成的信號肽,沒有跨膜區(qū),是極不穩(wěn)定的親水性蛋白。C5蛋白由5481bp核酸編碼的1688個氨基酸組成,氨基端有25個AA組成的信號肽,是穩(wěn)定的親水性蛋白。結構域分析結果顯示C3蛋白有8個主要的結構域,C5蛋白有10個主要的結構域,二者結構域相似,多為A2M家族的A2M、A2M＿N、A2M＿N＿2和MG1等,都存在過敏毒素ANATO結構域。通過序列比對及進化樹分析可知東方田鼠補體蛋白C3和C5均與草原田鼠的C3和C5蛋白親緣關系較近,兩種蛋白在進化過程中比較保守。
應用qPCR檢測C5分子在東方田鼠各主要器官的表達水平及C3和C5分子在東方田鼠感染日本血吸蟲尾蚴后動態(tài)表達水平。在正常的東方田鼠體內(nèi),C5在肝臟中表達最高。東方田鼠感染日本血吸蟲尾蚴后1d,肝臟和肺臟組織C3表達水平迅速升高,比未感染組高約94%和72.9%,感染后7d和14d較未感染組降低,感染后21d和28d和未感染組比升高或接近。和未感染鼠相比,補體C5基因在感染1d和7d的肝臟和肺臟中表達水平升高,感染后第14d,表達水平降低,至21d和28d,兩者轉錄水平接近。
結果表明C3和C5在肺肝組織中隨感染進程是升高-降低-回升（接近）的過程。東方田鼠感染尾蚴1 d、7 d、14 d、21 d、28 d和42 d的血清總補體活性CH50平均值分別為433 U/mL、395 U/mL、378 U/mL、411 U/mL、373 U/mL、555 U/mL和433 U/mL,結果表明東方田鼠感染血吸蟲后血清補體活性沒有顯著變化。
根據(jù)東方田鼠補體C3基因序列設計C3靶向的3條ShRNA序列,構建了3種重組腺相關病毒,病毒滴度為1011 GC/ml以上。rAAV8-sh RNA5-MfC3和scramble可以高效感染293T細胞,也可以感染Hepa1-6細胞,細胞感染后可見熒光信號,結果表明構建的重組病毒可以在肝細胞中表達。
Km鼠注射scramble與rAAV8-shRNA4-MfC3病毒4周后,其肝臟組織可見明顯的熒光信號,腎臟組織中scramble有明顯熒光,rAAV8-shRNA4-MfC3的熒光信號較弱。定量PCR檢測結果顯示,rAAV8-shRNA4-MfC3重組病毒可誘導肝臟C3表達量比scramble降低20.03%,4周后其抑制效率達62.70%（P<0.01）。結果表明,篩選到可抑制C3表達的重組腺相關病毒。
參考文獻
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