背景^[1-3]

HUH-7細(xì)胞專用培養(yǎng)基可保持HuH-7細(xì)胞的生長狀態(tài)。本產(chǎn)品中已包含HuH-7細(xì)胞生長所需的各種成分，無需添加任何成分，可直接用于HuH-7細(xì)胞的體外培養(yǎng)。HuH-7細(xì)胞分離自人肝癌組織可產(chǎn)甲胎蛋白、胰酶α抗體、血漿銅藍(lán)蛋白、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白等。

HUH-7細(xì)胞專用培養(yǎng)基

培養(yǎng)步驟

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3、輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4、按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

用于STYK1/NOK對HepG2及Huh-7細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞周期的影響研究

研究STYK1/NOK基因在肝癌細(xì)胞系HepG2（肝母細(xì)胞瘤來源）和Huh-7（肝細(xì)胞肝癌來源）中的作用并明確其作用機(jī)制。探討過表達(dá)STYK1/NOK對HepG2細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖的影響,反向驗(yàn)證,抑制STYK1/NOK蛋白表達(dá)對HepG2細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞周期的影響。隨后,在Huh-7細(xì)胞中驗(yàn)證,明確STYK1/NOK對肝癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響,以期揭悉STYK1/NOK影響肝癌細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制。

方法:在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)STYK1/NOK,通過western blotting檢測蛋白表達(dá)情況,確定STYK1/NOK過表達(dá)。使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測分別轉(zhuǎn)染0,2,6μg STYK1/NOK質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞的凋亡情況,每組重復(fù)3組,根據(jù)檢測結(jié)果制作柱形圖。

轉(zhuǎn)染0,2,6μg STYK1/NOK質(zhì)粒,48小時后,應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)STYK1/NOK對HepG2細(xì)胞增殖的影響,每組重復(fù)三組,隨后應(yīng)用OD值制作柱形圖。為了明確檢測結(jié)果,應(yīng)用siRNA抑制HepG2細(xì)胞STYK1/NOK蛋白表達(dá)后行細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn),并采用western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase 3,cleaved-caspase3及凋亡周期蛋白CDC25A,CDK2蛋白的表達(dá)情況,明確STYK1/NOK對HepG2細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。

并進(jìn)一步明確具體作用機(jī)制。隨后,相關(guān)實(shí)驗(yàn)在另一株肝癌細(xì)胞系Huh-7細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。過表達(dá)STYK1/NOK及通過應(yīng)用siRNA抑制Huh-7細(xì)胞STYK1/NOK蛋白表達(dá)后,行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),并應(yīng)用western bloting檢測抑制STYK1/NOK細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase 3及cleaved-caspase 3的表達(dá)情況,再進(jìn)一步檢測抑制STYK1/NOK蛋白表達(dá)后的細(xì)胞周期分布情況。

結(jié)果:在轉(zhuǎn)染48h后,收集細(xì)胞,提取蛋白,行western blotting檢測,檢測結(jié)果表明STYK1/NOK的表達(dá)與轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒濃度相關(guān),呈劑量依賴效應(yīng)。使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測過表達(dá)后HepG2細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染0,2,6μg STYK1/NOK質(zhì)粒組,細(xì)胞凋亡百分比逐漸減少,分別為21.1%,19.7%,16.3%,重復(fù)三組,應(yīng)用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,表明轉(zhuǎn)染STYK1/NOK抑制了HepG2細(xì)胞的凋亡。應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測,研究過表達(dá)STYK1/NOK基因?qū)?xì)胞增值的影響。

在轉(zhuǎn)染48 h后,加入CCK8試劑,2 h后進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)STYK1/NOK促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用siRNA抑制HepG2細(xì)胞STYK1/NOK蛋白表達(dá),再次行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制STYK1/NOK蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡,分別轉(zhuǎn)染0,2,6μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒,凋亡率分別為30.2%,30.6%,36.5%。

每組重復(fù)三組,行t檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染0μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染6μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒組凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抑制STYK1/NOK抑制HepG2細(xì)胞增殖（P<0.01）。Western blotting結(jié)果表明抑制STYK1/NOK蛋白表達(dá)后,caspase 3蛋白表達(dá)減少,cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)增加,表明抑制STYK1/NOK裂解活化了caspase3,促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期結(jié)果表明,抑制STYK1/NOK蛋白表達(dá)后,S期細(xì)胞增多,G0/G1、G2/M期細(xì)胞減少,Western blotting結(jié)果表明抑制STYK1/NOK蛋白表達(dá)后,CDC25A蛋白和CDK2蛋白表達(dá)下調(diào),表明抑制STYK1/NOK將HepG2細(xì)胞阻滯在S期,從而抑制細(xì)胞增殖。隨后,檢測結(jié)果在Huh-7細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證,細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與HepG2結(jié)果相符。抑制Huh-7細(xì)胞STYK1/NOK蛋白表達(dá)后,通過裂解活化caspase 3促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)

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