背景[1-3]
MC3T3-E1 SUBCLONE 14細胞是從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細胞系中分離出一系列亞克隆。從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長的成骨細胞中選擇高或低成骨細胞分化、礦化的亞克隆。MC3T3亞克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亞克隆14（ATCC CRL-2594）在抗壞血酸和3到4mM無機磷酸鹽中生長表現出高水平的成骨細胞分化。它們10天后形成一個礦化良好的細胞外基質（ECM）。
MC3T3亞克隆24（ATCC CRL-2595）和MC3T3亞克隆30（ATCC CRL-2596）在抗壞血酸中生長表現出很差的成骨細胞分化。不形成ECM，可以作為亞克隆4和14的陰性對照。礦化的亞克隆選擇的表達作為成骨細胞標記的mRNA，及唾液酸糖蛋白（BSP），骨鈣素（OCN），和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關蛋白受體的mRNA。
MC3T3-E1 SUBCLONE 14細胞
高或者低的分化潛能的亞克隆在培養(yǎng)中生產出相似數量的膠原質，表達可比較的基本水平的mRNA編碼Osf2/Cbfa1，一種成骨細胞相關轉錄因子。植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亞克隆形成與骨類似的形成小骨的編織骨，低分化細胞只是產生纖維組織。這些細胞系是研究體外成骨細胞分化的好模型，尤其是ECM信號。它們和原代培養(yǎng)顱頂成骨細胞的行為類似。培養(yǎng)條件培養(yǎng)基：90%MEMα(添加NaHCO3 1.5g/L，肌醇43.2mg/L,葉酸8.82mg/L,β-巰基乙醇7.8mg/L)+10%胎牛血清+1%雙抗；溫度：37℃；氣相：95%空氣，5%二氧化碳。
應用[4][5]
用于輻射與RNA干擾對MC3T3-E1 Subclone 14成骨樣細胞相關因子骨鈣素（OCN）影響的初步研究
對MC3T3-E1 Subclone 14細胞輻射與RNA干擾方法敲減ppGalNAc-T1處理后對OCN表達的影響進行研究,以判定多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉移酶1（ppGalNAc-T1）與OCN表達變化相關性,從而對ppGalNAc-T1基因在成骨細胞活性及分化機制中的作用及輻射的影響有一初步了解。
方法:1.對MC3T3-E1 Subclone 14細胞進行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后進行MTT測吸光值,觀察細胞在5天內的增殖情況差異。
2. 對MC3T3-E1 Subclone 14細胞進行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后,流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡差異。
3. 對MC3T3-E1 Subclone 14細胞進行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后換液培養(yǎng)至14d,RT-PCR檢測4d、7d、10d、14d時ppGalNAc-T1和OCN的表達差異。
4. 設計四條可能的ppGalNAc-T1小干擾RNA（siRNA）,分別將這四段siRNA插入到RNA干擾載體pGPU6/GFP/Neo中構建成四條干擾載體pGPU6/GFP/Neo-si ppGalNAc-T1-1,2,3,4。
5. 通過脂質體介導將四條干擾表達載體按轉染體系轉染MC3T3-E1 Subclone 14細胞,48小時后,RT-PCR方法檢測ppGalNAc-T1基因在轉錄水平的差異,篩選出對ppGalNAc-T1有抑制效果的干擾表達載體。
6. 將篩選出的干擾表達載體轉染MC3T3-E1 Subclone 14細胞,48小時后,通過RT-PCR方法檢測ppGalNAc-T1在mRNA的改變,并通過RT-PCR、Western-Blot方法分別檢測OCN mRNA和蛋白表達量的差異。
結果:1.0.5Gy、2.0Gy劑量輻射與空白對照組相比,不能明顯影響MC3T3-E1 Subclone 14細胞增殖能力（P>0.05）,而1.0Gy劑量輻射顯著能增強細胞增殖能力（P﹤0.05）。
2. 0.5Gy、2.0Gy劑量輻射與空白對照組相比,對MC3T3-E1 Subclone 14凋亡沒有明顯影響（P>0.05）,而1.0Gy劑量輻射對MC3T3細胞凋亡有顯著的抑制作用（P﹤0.05）。
3.0.5Gy,1.0Gy及2.0Gy劑量輻射與空白對照組相比,均能上調OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表達趨勢,其中1.0Gy組的表達顯著高于空白對照組（P﹤0.05）。
結論:1.輻射劑量1.0Gy可顯著促進MC3T3-E1 Subclone 14細胞增殖,抑制細胞凋亡,上調OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表達。
3. 利用SiRNA干擾技術,構建ppGalNAc-T1干擾表達載體,并成功篩選出一條有效的ppGalNAc-T1基因的siRNA載體。
通過檢測轉染后mRNA和蛋白水平表達量檢測,結果顯示:當有效阻斷ppGalNAc-T1基因表達,OCN基因的表達也顯著性受到抑制。為研究ppGalNAc-T1在成骨細胞分化與增殖過程中的作用提供了實驗基礎和理論支持,并為研究RNAi在臨床上的應用提供了技術支持。
參考文獻
[1]Dicers at RISC[J].Marcel Tijsterman,Ronald H.A Plasterk.Cell.2004(1)
[2]ATP Requirements and Small Interfering RNA Structure in the RNA Interference Pathway[J].Cell.2001(3)
[3]Evidence that conditionally immortalized human osteoblasts express an osteocalcin receptor[J].P.V.N Bodine,B.S Komm.Bone.1999(5)
[4]Molecular basis and clinical application of biological markers of bone turnover.Calvo MS,Eyre DR,Gundberg CM.Endocrine Reviews.1996
[5]趙俊宇.輻射與RNA干擾對MC3T3-E1 Subclone 14成骨樣細胞相關因子骨鈣素（OCN）影響的初步研究[D].蘇州大學,2011.