背景[1-3]
多克隆抗體制備是由異源抗原（大分子抗原、半抗原偶聯(lián)物）刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有機(jī)體漿細(xì)胞分泌的一組免疫球蛋白的過程。多克隆抗體由于其可識(shí)別多個(gè)抗原表位、可引起沉淀反應(yīng)，制備時(shí)間短，成本低的原因廣泛應(yīng)用于研究和診斷方面。
抗原通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原刺激所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（MonoclonalAntibody）。
由多種抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一種抗原決定簇，也可刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。
抗原刺激機(jī)體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機(jī)體的漿細(xì)胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白就是抗體。
多克隆抗體制備
多克隆抗體的制備一般包括以下幾個(gè)步驟：
1、制備抗原。
2、選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
3、動(dòng)物免疫。
4、試取血進(jìn)行測(cè)試，看看是否成功免疫。
5、如果成功免疫，殺死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采集全部血清。
6、純化出抗體。
7、鑒定抗體。包括純度以及特異性。
應(yīng)用[4][5]
用于豬ISG43和ISG60蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備
克隆了ISG60和ISG43基因,將這些基因連接到pMD18-T載體,測(cè)序正確后再用Xho I和BamH I雙酶切法插入PET-32a（+）克隆位點(diǎn),成功構(gòu)建了PET-ISG60和PET-ISG43重組原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）衍生菌并用不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),經(jīng)SDS-PAGE和Western-Blot分析顯示,ISG43在0.5 mM IPTG誘導(dǎo)下表達(dá),ISG60在0.05mMIPTG誘導(dǎo)下表達(dá),ISG43和ISG60兩者的重組蛋白都能以包涵體和可溶性蛋白兩種形式進(jìn)行表達(dá)。
通過可溶性蛋白形式純化蛋白獲得有活性的免疫原,以純化的ISG43和ISG60重組活性蛋白作為抗原與弗式佐劑一起免疫小鼠。經(jīng)過四次免疫后獲得了反應(yīng)性和特異性較高的多克隆抗體。
用Western Blot檢測(cè),產(chǎn)生的抗體能與原核表達(dá)蛋白發(fā)生反應(yīng),又能與PK-15細(xì)胞中經(jīng)PolyI:C誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)蛋白顯示良好反應(yīng)性。
抗體在稀釋比例為1:2000、1:4000、1:8000情況下都能與原核表達(dá)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。同樣,抗體在稀釋比例為1:600和1:1200時(shí)也能與PK-15細(xì)胞中表達(dá)的相應(yīng)蛋白發(fā)生反應(yīng)。
參考文獻(xiàn)
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[4]Ubiquitin specific protease 18（Usp18）is a WT1 transcriptional target[J].Mohammad Shahidul Makki,E.Cristy Ruteshouser,Vicki Huff.Experimental Cell Research.2013(5)
[5]姜炳星.豬ISG43和ISG60蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[D].廣西大學(xué),2017.