背景[1-3]
人抗乙型肝炎病毒表面抗體(HBSAB)ELISA試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人抗乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人抗乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
樣本處理及要求：
1.血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
操作步驟：
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
應(yīng)用[4][5]
用于人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗體的研究
人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗體表達(dá)及功能鑒定在利用原核細(xì)胞XL1-Blue表達(dá)Fab抗體的基礎(chǔ)上,分別利用哺乳動(dòng)物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了全抗體的真核分泌表達(dá)。
將篩選出的20株抗體中具有高滴度6株Fab抗體的輕鏈和重鏈Fd段基因插入桿狀病毒載體pAc-L-FcR中,然后將構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒與桿狀病毒重組后轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞,同時(shí)將其輕重鏈可變區(qū)基因插入HL51-14哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體后,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
通過(guò)直接免疫熒光檢測(cè)真核表達(dá)效果,收集昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)上清進(jìn)行親和層析純化。利用SDS-PAGE檢測(cè)純化后抗體的純度、ELISA方法檢測(cè)純化后的抗HBsAgIgG全抗體的功能活性,結(jié)果表明純化后的人源HBsAg單克隆抗體抗體純度達(dá)到98%以上,并且具有良好的生物活性。
參考文獻(xiàn)
[1]Epidemiology of Hepatitis Virus B and C[J].Archives of Medical Research.2007(6)
[2]Mechanism of viral persistence and resistance to nucleoside and nucleotide analogs in chronic Hepatitis B virus infection[J].Fabien Zoulim.Antiviral Research.2004(1)
[3]Baculovirus expression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phage display selected antibody fragments[J].Mifang Liang,Stefan Dübel,Dexin Li,Iris Queitsch,Wei Li,Ekkehard K.F Bautz.Journal of Immunological Methods.2001(1)
[4]Efficacy and limitations of a specific immunotherapy in chronic hepatitis B[J].Journal of Hepatology.2001(6)
[5]劉洋.人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗體的研究[D].中國(guó)疾病預(yù)防控制中心,2012.