背景及概述[1]
(3R,4S)-3-羥基-4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮，簡稱(-)β-內(nèi)酰胺，它是一種非常具有潛力的手性藥物中間體，它有兩種異構(gòu)體即（3R,4S）構(gòu)型和（3S,4R），其中（3R,4S）構(gòu)型的異構(gòu)體的衍生物紫杉醇側(cè)鏈C-13是制備癌癥臨床化療最具應(yīng)用前景的新藥之一多西紫杉醇的重要手性前體。
制備[1]
一種大豆慢生根瘤菌全細胞拆分3-羥基-4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮。該方法包括如下步驟：
（1）菌種選擇：選用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作為菌種，菌種保藏號為CGMCC No.1.2550；該菌種保藏于-80℃；
（2）發(fā)酵液制備：將所述的大豆慢生根瘤菌菌種以0.1%～0.5%的體積比接種到根瘤菌培養(yǎng)基中，20℃～30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)96～168h；
根瘤菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，土壤提取液200ml，蒸餾水800ml，pH7.2；
其中土壤提取液：25g土壤，加去離子水100ml，105kPa蒸煮1小時，過濾后加水補足到蒸煮前體積；
具體制備方法為：將酵母提取物、甘露醇、土壤提取液溶于去離子水，以NaOH調(diào)PH 值至7.2，于121kPa滅菌20min，得到所述的根瘤菌發(fā)酵培養(yǎng)基；
（3）菌體收集：將培養(yǎng)得到的菌體發(fā)酵液與pH值為7.0的磷酸緩沖液按照一定比例充分混合，得到稀釋發(fā)酵液；然后在8000～11000rpm轉(zhuǎn)速下離心10～15min，收集菌體沉淀； 再次用pH值為7.0磷酸鹽緩沖液進行洗滌處理，離心后回收得到濕菌體，收集濕菌體作為生物催化劑使用；
所述的pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液由0.05mol/l的Na2HPO4溶液和0.05mol/l的 NaH2PO4溶液混合而成，其體積比為7:3。
（4）生物拆分反應(yīng)：將所述的濕菌體與1～10g/L消旋體β-內(nèi)酰胺溶液混合，得到菌體混合液，其中500ul反應(yīng)體系中包含60mg濕菌體；將所述的菌體混合液進行振蕩培養(yǎng)，得到反應(yīng)液；所述的消旋體β-內(nèi)酰胺溶液為消旋體β-內(nèi)酰胺與通用緩沖液，經(jīng)過一定時間的超聲處理后制得；
所述的不同pH值的通用緩沖液為Tris50mM；Boric acid 50mM；檸檬酸33mM； Na3PO4 50mM。用HCl，NaOH調(diào)pH3～12。
所述的振蕩培養(yǎng)的溫度為25℃～50℃，pH值5.0～10.0條件下，轉(zhuǎn)速為200～ 220rpm，時間為3h～24h；
（5）樣品分離：將所述的振蕩后的菌液進行離心處理，轉(zhuǎn)速為8000～12000rpm，時間為5～10min，得到上清液，即為所述的（-）β-內(nèi)酰胺樣品。
（6）HPLC測定：取500μL所述的（-）β-內(nèi)酰胺樣品與200μL乙酸乙酯充分震蕩萃取，使目標(biāo)產(chǎn)物溶解于乙酸乙酯；再取10μL所述的溶有目標(biāo)產(chǎn)物的乙酸乙酯進樣，利用手性 HPLC測定（+）β-內(nèi)酰胺及（-）β-內(nèi)酰胺的含量，計算得出ee值和（-）β-內(nèi)酰胺的產(chǎn)率。
（7）以上所述的消旋體β-內(nèi)酰胺為3-羥基-4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮或3-乙酰氧基- 4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮。
（8）對應(yīng)于步驟（7）中的全細胞拆分后所得(-)β-內(nèi)酰胺分別為(3R,4S)-3-羥基- 4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮或（3R,4S）3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮。
（9）3-羥基-4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮HPLC檢測條件：色譜柱型號為Daicel公司 Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；以大賽璐AS-H手性柱作為固定相，100%乙腈，流速0.6ml/ min，檢測波長210nm。
（10）3-乙酰氧基-4-苯基-2-氮雜環(huán)丁酮HPLC檢測條件：色譜柱型號為Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；以大賽璐AS-H手性柱作為固定相，100%乙腈，流速0.4ml/ min，檢測波長210nm。
主要參考資料
[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)] CN201410081161.8 一種以大豆慢生根瘤菌全細胞拆分消旋體β-內(nèi)酰胺的方法【授權(quán)】