概述^[1]

在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)提取過(guò)程中，有些蛋白質(zhì)比較難溶解，因此比較難以提取，需要變性裂解液進(jìn)行提取，其適于不溶性細(xì)胞骨 架、膜蛋白、高度疏水蛋白，或者集聚并形成沉淀的蛋白，或者體外翻譯產(chǎn)生的蛋白。適用于SDS-PAGE、等電點(diǎn)聚焦和2-D 電泳。

保存條件^[1] 

常溫下運(yùn)輸，收到后將溶液A，溶液B放在-20°C環(huán)境中保存，保質(zhì)期兩年。

操作步驟^[1] 

培養(yǎng)細(xì)胞裂解

貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用 PBS洗一遍。懸浮細(xì)胞，離心收集，PBS洗一遍。通常每107個(gè)細(xì)胞或100 mm培養(yǎng)板或150 cm2 培養(yǎng)瓶，可加1 mL溶液A和10 μL溶液B。裂解液和細(xì)胞應(yīng)充分接觸。   冰上放置5-10 min，為促進(jìn)細(xì)胞裂解,可用槍頭輕輕吹打；輕輕傾斜培養(yǎng)皿使裂解產(chǎn)物流向瓶皿的一邊或一角，然后將之 轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管。在冰上放置5 min，期間劇烈震蕩3-4次，每次30 sec。   12000 rpm（12830g）， 4°C離心5 min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的電泳、Western或免疫沉淀操作。

組織塊裂解

組織剪切成細(xì)小的碎片。每100毫克組織加入1 mL溶液A和10 μL溶液B。置玻璃勻漿器冰上均質(zhì)30～50次，或超聲破碎 細(xì)胞，每次30 sec，3～4次，每次間隔1 min，置于冰上冷卻。均質(zhì)或超聲破碎細(xì)胞后應(yīng)鏡檢，細(xì)胞破碎率不小于90%, 同時(shí)組織已經(jīng)完全裂解，沒(méi)有明顯的小組織塊。   將勻漿物轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，在冰上放置10 min，期間劇烈震蕩3-4次。   12000 rpm，4℃離心5 min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的電泳、Western 或免疫沉淀操作。

已經(jīng)提取的細(xì)胞骨架膜蛋白,膜蛋白或高度疏水蛋白，或者集聚并形成沉淀的蛋白的溶解   

將1-5 mg 的相關(guān)蛋白質(zhì)樣品加入1mL的溶液A，10 μL溶液B 混合，靜置30 min，渦旋震蕩1 min，離心后取上清。

使用注意事項(xiàng)^[1] 

1. 溶液A若有沉淀析出，可置于30°C水浴中保溫10 min，并震蕩混勻，待沉淀完全溶解，冷卻至室溫后，即可使用。

2. 裂解液中蛋白樣品含有影響因子，不能用Bradford法和BCA法，但可用改良型Lowry法（C504041）或非干擾型蛋白定 量試劑盒（C503071）測(cè)定蛋白濃度。

3. 在細(xì)胞裂解時(shí)，如果在進(jìn)行步驟4前裂解液比較粘，可以先勻漿或超聲以剪斷基因組，再離心取上清。

主要參考文獻(xiàn)

[1] 王義強(qiáng) 譚曉風(fēng) 陳介南 周小慧 孫吉康；銀杏雌樹(shù)成熟葉cDNA文庫(kù)的構(gòu)建?！吨心狭謽I(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版》2009年 第1期。