QuickMutation™基因定點突變試劑盒

信裕生物生產的QuickMutation™基因定點突變試劑盒(QuickMutation™ Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成質粒DNA的點突變(point mutation)，多個鄰近密碼子的突變，單個或多個鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)突變。
基因定點突變常用于研究基因的轉錄調控、RNA或蛋白質的結構和功能，以及用于質粒中部分序列的微調等。
本試劑盒利用了目前最常用的基因點突變技術，只需通過基于PCR的突變質粒的生成，和基于DpnI的模板質粒的消化，轉化培養(yǎng)以及后續(xù)的酶切或測序鑒定，即可得到預期的突變質粒 (參考圖1)。DpnI消化僅需5分鐘，累計操作時間不足2小時即可完成
基因的定點突變。

圖1.基因定點突變試劑盒原理圖

本試劑盒使用了最新的保真性更強，靈敏度更高，擴增速度可達2kb/min，擴增長度可達12kb的BeyoFusion™ DNA Polymerase，從而大大縮短了突變反應所需的時間，進一步提高了基因定點突變的成功率。同時進一步嚴格驗證了試劑盒中的DpnI，確保能在5分鐘內充分消化掉甲基化的模板質粒，同時不會消化未甲基化的PCR產物。
參考圖1，使用本試劑盒時需要先設計長度通常為25-45個堿基互補的兩個引物，在引物中含有預期的突變位點。然后以待突變的質粒為模板，用這兩個引物進行PCR擴增反應。這樣可以產生含有預期的突變位點的雙鏈質粒，但這個雙鏈質粒中有兩個nick位點。待突變的質粒通常來源于DH5α等dam⁺大腸桿菌，在這些dam⁺細菌中質粒會被甲基化修飾，而在體外通過PCR擴增得到的質粒不會被甲基化。這樣用特異性識別甲基化位點的酶DpnI處理，可以消化掉待突變的質粒模板，而使通過PCR擴增出來的含有突變位點的質粒被選擇性地保留下來。隨后把DpnI處理過的產物轉化感受態(tài)細菌后，突變質粒中的兩個nick位點可以被大腸桿菌修復，得到的克隆就會含有預期的突變質粒了。
本試劑盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受態(tài)細菌的制備。
本試劑盒分別使用6kb和12kb的質粒進行了點突變測試，實測突變率接近100%(參考圖2)。實際進行點突變時，可能會因為突變引物的設計、模板使用量、感受態(tài)效率等因素出現不同的突變率。

圖2. 本試劑盒實際使用效果圖。A. 使用本試劑盒進行點突變獲得的LB平板照片。以一個6kb質粒為模板，使用本試劑盒進行PCR擴增以實現點突變，DpnI 37℃消化5min，取10μl產物轉化100μl DH5α感受態(tài)，涂板后37℃培養(yǎng)過夜所獲得的LB平板照片。B. 陰性對照LB平板照片。與A相比沒有添加BeyoFusion™ DNA Polymerase，這樣模板質粒完全被DpnI酶所消化，沒有任何的假陽性克隆產生。C. 突變前后的測序圖。突變前的測序結果(WT, wild type)和從圖A中挑取9個克隆的測序結果(Mu,mutant)。箭頭所示為擬突變的位點，紅色下劃線的為突變前和突變后的堿基。本次實驗的突變率達到了100%。

本試劑盒共可以進行十次基因定點突變反應。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項：
需自行配制LB液體培養(yǎng)基和LB平板以用于細菌的培養(yǎng)。
需自行設計和合成用于基因定點突變的引物。需自備用于細菌轉化的試劑。
使用本試劑盒前請先閱讀后面的常見問題。
本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. 引物設計：
用于特定基因突變的引物需要單獨設計，請參考如下一些基本原則進行設計：
a. 共需設計兩條互補的引物?？梢韵燃性O計一條，然后就可以得到互補的另一條引物。
b. 引物的長度通常為25-45個堿基。
c. 利用如下公式進行引物Tm值的估算，通常Tm值應該不低于78℃。
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - (675/N) - %mismatch
N表示引物所含堿基總數
%GC表示引物中GC堿基數占引物總堿基數的百分值，例如GC含量為50%，那么%GC就是50。
%mismatch表示引物中突變堿基數占引物總堿基數的百分值，例如錯配率是2.5%，那么%mismatch就是2.5。
例一：對于模板序列5'-CCAATTTCGAGGAATTAGAACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3'，其中帶有灰色陰影的A為待突變位點，需要突變?yōu)镃，設計正向突變引物如下:
5'-CCAATTTCGAGGAATTAGCACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3' 
Tm = 81.5 + 0.41*(15/43)*100 - (675/43) - (1/43)*100 = 77.8
例二：對于模板序列5'-GGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGA-3'，其中兩個有灰色陰影的A為待突變位點，均需要突變?yōu)镚，設計正向突變引物如下：
5'-GGGAGCTCACCAGGCTGAGGAGCACCTACATTGA-3' 
Tm = 81.5 + 0.41*(20/34)*100 - (675/34) - (2/34)*100 = 79.9
對于插入、缺失型的突變引物，推薦利用如下公式進行引物Tm值的估算： 
Tm=81.5 + 0.41(％GC) ? (675/N)
此公式中，N不包含插入或缺失的堿基。因為如果N包含插入或缺失的堿基，數字可能會比較大，從而影響計算結果。
d. 也可以利用如下公式進行引物設計。
引物中突變位點任何一側都必需滿足4*(GC堿基數) + 2*(AT堿基數) ≥ 45。但引物也不宜過長，否則通常會形成非常穩(wěn)定的二級結構。通常把突變位點兩側的堿基數控制在15個左右，且使兩側按照上述計算得到的數值相近。
例如引物為AGTCAGGCCAATTCGAAGCAGTCGAATTGCCAAG，其中有灰色陰影的AAG為突變位點，則
左側：4*(GC堿基數) + 2*(AT堿基數) ＝ 4*8 + 2*7 ＝ 46 ≥ 45
右側：4*(GC堿基數) + 2*(AT堿基數) ＝ 4*8 + 2*8 ＝ 48 ≥ 45
e. 上述c和d這兩種方法的計算標準有較明顯的差異，但經過多次測試，兩種方法都可以順利獲得預期的突變。
f. 在可能的情況下，盡量把引物的GC含量控制在40-60%。
g. 在可能的情況下，盡量使引物不要產生非常穩(wěn)定的二級結構和引物二聚體。二級結構和二聚體可通過一些軟件進行分析。
h. 使用經過PAGE純化的引物或更高純度的引物。
2. 引物的配制：
如果合成得到的一個引物A的量是20nmol，另外一個互補引物B的量是19nmol。在引物A中加入200μl水，配制成濃度為100μM，在引物B中加入190μl水也配制成濃度為100μM。吸取20μl 100μM引物A和20μl 100μM引物B到一新的離心管中，再加入160μl水，混勻后即可得到可以直接用于基因定點突變反應的引物(10μM each)。
3. 待突變模板質粒的選擇：
選擇GC含量在40-55%的待突變模板質粒，并且每一個50bp左右的局部GC含量也不超過70%。如果GC含量過高，請先把目的基因克隆到其它合適的載體上，再進行基因定點突變反應。另外目的基因GC含量也在40-55%的范圍，并且每一個50bp左右的局部GC含量也不超過70%。如果目的基因GC含量過高，而突變位點不在高GC含量區(qū)域，可以先把該基因的不含高GC含量的一個區(qū)域克隆出來，進行定點突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的質粒模板，或者有局部高GC含量的質粒模板，請另外使用專門用于高GC含量模板的PCR反應試劑。
必須使用從dam⁺的大腸桿菌(這類菌中質?？梢员患谆?中抽提得到的質粒用于基因定點突變。常用的大部分大腸桿菌都是dam⁺的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定點突變反應：
a. 如下設置基因定點突變反應體系：

按照上面的順序依次加入各種試劑。在上述反應體系中，根據待突變模板質粒的量，計算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使總體積為49μl。適當混勻后，加入1μlBeyoFusion™ DNA Polymerase，混勻。如果用的PCR儀沒有熱蓋，在反應體系上加入一滴礦物油(mineral oil)以防止蒸發(fā)。
b. 按照如下參數設置PCR儀：

       說明：上面表格中30sec/kb表示，如果待突變的質粒為6kb，那么68℃的延伸時間為3分鐘。60sec/kb的含義相同。
5. DpnI消化：
PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入1μl DpnI，混勻后37℃孵育5min。37℃孵育可以在PCR儀上進行，也可以在水浴鍋中進行。DpnI消化完畢后可以直接用于轉化，或者-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 6. 轉化、挑克隆鑒定：
感受態(tài)細菌的轉化效率必需至少在10⁷以上，否則很難得到克隆。根據所使用的感受態(tài)細菌，加入盡量多的經過DpnI消化后的突變產物用于轉化。通常每100μl感受態(tài)細菌中可以加入5-10μl經過DpnI消化后的突變產物。按照所使用的感受態(tài)細菌的操作方法進行操作，在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌，全部涂布到含有適當抗生素的平板上，培養(yǎng)過夜。通常會得到100個以下的克隆。如果發(fā)現有上千個克隆，那么通常是有什么地方出了問題。
對于得到的克隆，可以挑取3-5個克隆送樣測序去測序，以確認得到的克隆是否是預期的突變克隆。通常大部分的是預期的突變克隆。但有時也可能會因為隨機因素，會測序了3-5個克隆才得到一個預期的突變克隆。

常見問題：
1. 轉化后沒有克隆或克隆數極少：
a. 感受態(tài)細菌效率不夠高，請檢測一下感受態(tài)細胞的效率，確保轉化效率在10⁷以上，當然高一些更好。
b. 把DpnI消化后的產物用常規(guī)的乙醇沉淀方法進行沉淀，然后溶解在較小的體積中。這樣就可以把所有的產物全部用于轉化。
c. 優(yōu)化基因定點突變中的PCR參數。可以把最初的95℃變性時間延長為5min，循環(huán)中95℃變性的時間延長至1min，把循環(huán)中的68℃的延伸時間改為1min/kb 至2min/kb，退火可以改為60-55℃或65-55℃等的touch down，退火時間也可以適當延長。
d. 引物設計有問題。通過突變反應中的PCR沒有很好地擴增出預期的突變質粒。
e. 如果使用礦物油(mineral oil)，在轉化時如果把礦物油帶入感受態(tài)菌，會嚴重影響轉化效率。
2. 有克隆，但沒有或很難檢測到預期的突變克?。?br /> a. DpnI消化效果不佳。一種可能是加入DpnI后，由于該酶在甘油中，會迅速下沉，如果沒有混勻就會嚴重影響DpnI的消化作用。另一種可能是DpnI由于保存不當或保存時間過長等原因導致活性下降，這時可以適當延長消化的時間至1-2小時。
b. 使用的待突變的模板質粒量過多，導致DpnI消化時不完全。我們這里推薦的模板質粒用量0.5μg，已經是模板質粒用量的上限，不能再使用更多的模板質粒了。
c. 盡量避免多次反復凍融dNTP。可以把dNTP適當分裝后再使用。
3. 有突變克隆，但突變位點不是預期的位點：
a. 引物設計不佳，并且PCR反應中退火溫度過低，導致引物退火到錯誤的地方。
b. 引物質量較差，沒有經過PAGE純化。這樣引物中通常會含有比設計的引物要短的特異性較差的引物，容易導致非預期的突變